生物制药工艺学 微生物药物的工业 生产.ppt

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1、第四章微生物药物的工业生产生物制药工艺学微生物药物工业生产的组成发酵分离菌种菌种选育菌种分离纯化菌种制备保存摇瓶种子制备罐上种子制备发酵生产发酵液预处理产物提取产物精制纯化微生物药物一.菌种工艺与技术微生物药物的产生菌1.放线菌是一类具有丝状分枝细胞和无性孢子的G+原核微生物,由于菌落呈放射状而得名。放线菌中链霉菌属占到50%，但是目前从稀有放线菌中发现的新的次生代谢物越来越多。2.真菌包括了霉菌、酵母菌和大型真菌。其中霉菌是主要的次生代谢物来源，也是最早发现次生代谢物的微生物。近年来，植物内生真菌的研究成为重点，如从红豆杉科植物体寻找可产紫杉醇的内生真菌。3.细菌所产次

2、生代谢物比例最少，以假单孢菌和芽孢杆菌为主要产生菌。但部分特殊种属，如黏细菌、光合细菌能产生罕有而重要的次生代谢物，如抗癌药物埃博霉素、抗氧化剂辅酶Q10等。一.菌种工艺与技术新抗生素产生菌比例（据日本抗生素杂志）放线菌的菌丝结构一.菌种工艺与技术菌种的选育1.寻找产生新化合物的菌种（略）2.现有微生物药物产生菌种的选育目的：a.提高目标产物的产率水平，降低杂质组分含量b.提高菌种对工业化生产条件的适应力方法：a.自然纯化选育b.传统诱变选育（紫外线、诱变剂、离子束）c.代谢调控和条件模型选育d.基因工程选育一.菌种工艺与技术工业用菌种的分离纯化正常菌退化菌传代传代传代微

3、生物遗传变异是绝对的，稳定是相对的；退化性的变异是多数的，进化性的变异是少数的。不对工业用菌种加以分离纯化，剔除变异菌，那么通过传代的累积效应，退化变异菌种将占据种群遗传优势。最终导致生产水平的波动和下降。一.菌种工艺与技术菌种分离纯化流程（例）保存菌种涂布平板点种平板斜面稀释涂布单菌落点种接斜面扩增生产能力鉴定斜面斜面一.菌种工艺与技术菌种制备保存方式：1.短期制备保存短期制备保存方式主要用于生产用菌种的扩增制备和短时保存。保证培养物能够短时的保存在常温或者冷藏条件下，随时应用于生产。主要包括：菌落平板试管/茄子瓶斜面麸皮/米孢子培养物2.中长期制备保藏中长期制备保存方

4、式主要用于菌种中长期保存，保证菌种的遗传特性和活力，保证生产菌种有可靠来源。主要包括：冷冻甘油管保藏冷冻干燥管保藏液氮甘油管保藏沙土/石蜡管保藏二.发酵生产发酵生产流程概况生产菌种培养摇瓶种子培养一级种子罐培养二级种子罐培养发酵罐培养微生物药物的发酵生产包括种子培养和发酵产抗两个阶段。种子培养阶段通过连续的扩增培养，获得足够量健壮均一的种子投入发酵生产。发酵产抗包括生长期和生产期，生长期仍以菌量的扩增为目的；当营养消耗等条件适宜后，微生物即开始产抗，进入生产期。二.发酵生产发酵种子培养迟滞期对数期平台期衰亡期种子生长曲线种龄菌量种子的评价指标：生长健壮旺盛，移入下一级后能

5、迅速生长，迟滞期短菌体稳定均一，生长同步性好菌体总量和生长密度适宜无杂菌污染二.发酵生产发酵种子培养的调控1.培养基碳源、氮源、无机盐、生长因子是微生物生长的四大营养要素。一般而言，种子配方中碳/氮比要求均衡，量以满足生长为宜，优质有机氮源要有一定比例。碳氮源种类选择上则必须了解菌种的利用能力，并配合考虑种龄种量和发酵配方中碳氮源组成。2.环境因素影响菌种生理活性的因素包括了温度、PH、溶氧、渗透压、离子强度等。不同的菌种都有着其最适应的范围，从而进行正常的生理代谢。所有上述因素的选择在种子阶段都应以菌种的生长最适条件来进行选择。3.种子级数的设计种子培养级数越多，培养周

6、期越长，过程中可能出现的不稳定因素越多。在设备条件允许的情况下，应尽可能缩减种子培养级数，提高每一级培养下菌体的扩增量，保证下一级需要。二.发酵生产迟滞期对数期平台期衰亡期发酵曲线发酵周期生长期生产期次生代谢发酵原理：当微生物生长到一定阶段，由于营养减少和有害代谢物积累，使比生长速率下降趋零。为了维持生存，微生物体触发有关次生代谢基因，产生次生代谢物。以取得环境竞争优势，保存自身。二.发酵生产发酵生产流程培养基投料溶解移入发酵罐定容调节灭菌前pH值高压蒸汽灭菌降温至培养温度种子液移入调节空气流量、搅拌速度、罐顶压至规定值，开始发酵二.发酵生产影响发酵的相关因素—培养基1.

7、碳源碳源用于提供微生物能量来源、构建细胞和形成产物。碳源包括单糖、双糖、多糖、天然复合物、油脂、低级醇烃等，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、面粉、豆油、甘油等。当培养基中碳源达到5%以上就形成高渗透压溶液，影响发酵。同时在一定浓度下碳源会阻遏产物合成酶，形成碳分解代谢物阻遏。2.氮源氮源是微生物蛋白质和其他含氮有机物的来源，也参与形成含氮产物。氮源包括无机氮源和有机氮源，如氨盐、硝酸盐、玉米浆粉、蛋白胨等。无机氮中的铵离子及有机氮通过降解得到的铵离子也有阻遏产物合成酶的性质。3.矿物盐磷酸盐、镁盐、钙盐是微生物能量代谢和生长的参与因素。