项目14细胞免疫功能测定.doc

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1、项目14：细胞免疫功能测定【目的要求】1、熟悉非特异性免疫细胞功能的测定方法2、了解特异性免疫细胞的测定方法和应用【实验内容】一、吞噬细胞吞噬功能测定【原理】具有吞噬功能的细胞称为吞噬细胞，包括小吞噬细胞和大吞噬细胞二类。小吞噬细胞一般指血液中的中性粒细胞，大吞噬细胞则是存在于组织中的巨噬细胞和血液中的大单核细胞。病原微生物、红细胞等异物侵入机体或在体外与吞噬细胞接触，吞噬细胞即进行吞噬。取细胞作涂片，镜检计算吞噬百分率和吞噬指数，可估计吞噬细胞的吞噬功能。吞噬细胞（巨噬细胞）在体液免疫和细胞免疫中均起着重要作用，吞噬细胞（巨噬细胞）与抗肿瘤免疫也有重要的关系。因此，测定吞噬细胞

2、的吞噬和消化功能，可在一定程度上反映机体的免疫状态，也可作为判断疗效的指标之一。【实验动物与试剂】1、实验动物：小白鼠2、实验试剂：无菌生理盐水、5%无菌可溶性淀粉溶液、瑞氏染液、白色葡萄球菌培养物3、实验器材：无菌注射器、吸管、载玻片、解剖器械、显微镜等。【方法】1、试验前3天，小鼠腹腔注射5%无菌可溶性淀粉溶液1ml。2、试验当天，小鼠腹腔注射1mL白色葡萄球菌悬液。3、注射后30min，断颈处死小鼠，仰位固定小鼠，正中剪开腹部皮肤，吸出腹腔液制定涂片，自然干燥后瑞氏染液染色。4、瑞氏染液染色：在涂片上滴3~5滴瑞氏甲液，30~60sec后,滴加瑞氏乙液,并用洗耳球吹数下,将

3、乙液与甲液充分混均,5~10min后,水洗,干燥,镜检.5、镜检：低倍对光，用油镜下观察巨噬细胞吞噬细菌的情况。【结果观察】1、吞噬细胞吞噬现象镜下观：如染色结果正确，可见细胞核及被吞噬的细菌染成紫色，而白细胞浆则为淡红色。2、吞噬细胞吞噬功能的测定（1）吞噬百分率：观察100个吞噬细胞，计数被吞噬百分率以表示吞噬细胞的吞噬功能。（2）吞噬指数：观察100个中性粒细胞，计数被吞噬的细菌总数，平均每个中性粒细咆吞噬的细菌数即为吞噬指数。三、特异免疫细胞功能测定（一）T淋巴细胞数量测定——E花环试验【原理】人成熟T淋巴细胞表面的CD2分子，即为绵羊红细胞受体（ER）。在一定的实验条件

4、下，绵羊红细胞（SRBC）可与人T淋巴细胞CD2分子结合，形成玫瑰花结，称为E玫瑰花结试验(erythrocyte-roseetteformationtest)。E花结的形成是T淋巴细胞所独特的标志。该试验常用于临床检测人外周血T淋巴细胞的数量和比例，由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况。【材料】1.淋巴细胞分离液。2.肝素。3.无Ca2+、Mg2+的Hanks液，pH7.2～7.6（见附录Ⅰ）。4.阿氏液。（见附录Ⅰ）5.绵羊红细胞悬液：用Alsever溶液保存的绵羊外周血用Hanks溶液洗涤3次，每次离心1500r/min×10min。将压积SRBC配制成1%绵羊红细胞悬液。

5、6.吸收灭活胎牛血清，胎牛血清经56℃30分钟灭活后，按每毫升胎牛血清中加洗涤过的压积绵羊红细胞0.1rnl，混匀，于37℃温浴30分钟，再经2000r/min离心20min，取上清液置4℃保存。7.0.8%戊二醛溶液。8.瑞氏染液或姬姆萨染液。9.华氏管、吸管、滴管、水平离心机、水浴箱、冰箱、显微镜等。【方法】1.取肝素抗凝血1ml，加Hanks溶液等量稀释后，沿试管壁缓缓将血加到盛有2ml淋巴细胞分离液之上，水平离心2000r/min×20min。2.小心吸取分离液界面白色的淋巴细胞层，用Hanks溶液洗涤2次，每次离心1500r/min×10min。弃上清，用Hanks溶液

6、调整细胞浓度至2×106/ml（详见实验十五淋巴细胞分离方法）。3.取0.1ml淋巴细胞悬液，加入0.1ml已吸收灭活的胎牛血清，再加入1%SRBC悬液0.1ml，混匀，37℃温浴5分钟，离心500r/min×5min。然后置于4℃冰箱，至少2h或过夜。吸去部分上清，轻轻旋转悬起细胞，沿管壁加1滴0.8%戊二醛固定细胞，置4℃冰箱静置20min。4.轻轻吸取1滴涂片，待自然干燥后，用姬姆萨染色或瑞氏染液染色，镜下观察。【结果观察】凡淋巴细胞周围结合3个或3个以上绵羊红细胞者即为E花结阳性。计数200个淋巴细胞中形成花结的淋巴细胞百分率。形成花结的淋巴细胞数×100%E花结形成率＝

7、（形成花结+未形成花结）淋巴细胞数正常参考值：为60%～80%，少于50%为降低。注意事项1.SRBC最好用新鲜的，一般采血后保存在Alsever液中，2周内可以使用，超过2周则与淋巴细胞的结合能力显著下降。2.从采血到测定，不得超过4h。否则CD2分子易于自行脱落。同时可用台盼蓝检查活力，活细胞应不少于95%。3.计数前应将沉于管底的细胞重悬，但操作要轻柔，不能过猛或强力吹打，否则会使CD2分子丢失或减少。4.SRBC与淋巴细胞结合形成花结后，操作更要轻柔，否则花结容易脱落。5