玉米晚报叶斑病菌的荧光标记GFP和DsRed.ppt

《玉米晚报叶斑病菌的荧光标记GFP和DsRed.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、报告人：陈茂功指导老师：周印富教授王晓鸣研究员林小虎教授玉米弯孢叶斑病菌的荧光标记及其在玉米侵染过程研究汇报内容研究背景1农杆菌介导的新月弯孢转化2转化子插入突变分析3新月弯孢对玉米侵染过程4玉米弯孢叶斑病抗病资源筛选5致谢7全文结论6一.研究背景玉米弯孢叶斑病发生与危害玉米弯孢叶斑病（Curvularialeafspot），又称黑霉病、拟眼斑病，在我国主要是由新月弯孢（Curvularialunata（Wakker）Boed.）引起，是继玉米大斑病、小斑病后又一主要叶部病害。在我国，上世纪70

2、年代起偶有发生。至80年代，随着气候变化和栽培制度变更，该病害逐步开始流行，相继蔓延到我国辽宁、北京、河北、河南、陕西、山东、吉林和天津等十余个省市。叶片叶鞘茎苞叶弯孢叶斑病是突发性病害，发生蔓延迅速，严重时叶部病斑密集成片，病株率及病叶率高达100%。一般玉米减产20%～30%，严重时减产50%以上，甚至绝收。北京昌平严重弯孢菌叶斑病品种农杆菌介导的遗传转化农杆菌T-DNA转化真菌机制示意图目前农杆菌介导的遗传转化已经成功用于多种真菌的遗传转化，其中包括子囊菌纲（48个种）、担子菌纲（8个种）

3、、接合菌纲（4个种）和卵菌纲（3个种）。尤其那些传统方法很难转化的，如长蠕孢霉、双孢蘑菇、玉米大斑病菌、玉米弯孢叶斑病菌等。用于病原菌在植株中侵染途径的研究用于植物病原菌及生防菌在植物根部的定殖研究作为报告基因用于抗病转基因植株的筛选用于病原菌致病基因表达活力的研究荧光蛋白在植病中的应用普通显微镜观察荧光显微镜观察玉米弯孢叶斑病抗性研究抗性资源筛选方法：孢子悬浮液高压喷雾接种待玉米四叶期时，以接种液（Tween20：0.02%；无菌水）调节分生孢子浓度至1.0×106个/mL，用高压喷雾的方法接

4、种于叶片。病级评价标准：1级—叶片上无病斑或病斑面积≧5%；3级—少量病斑（6~10%）；5级—叶片上病斑较多，占叶面积（11%~30%）；7级—叶片上有大量病斑，病斑相连，占叶面积（31%~70%）；9级—叶片基本为病斑覆盖，叶片枯死；目前对该病害研究主要集中在抗病品种与病菌变异和致病机理等方面，但对该病菌在玉米叶片上的侵染及发育过程仍不十分清楚。运用荧光蛋白（绿色和红色）标记新月弯孢，通过生理生化等指标的筛选得到与野生菌相近的转化子，利用转化子观察新月弯孢在玉米叶部的侵染过程，分析新月弯孢在

5、抗感玉米中侵染过程的差异。本文研究目的及意义技术路线二.农杆菌介导的新月弯孢转化筛选抗生素的确定头孢噻肟钠对农杆菌抑菌浓度的测定潮霉素B对分生孢子萌发抑制浓度的测定0501001502000503075100150农杆菌介导转化因素的优化共培养介质受体材料孢子萌发时间共培养温度和时间当弯孢病菌分生孢子萌发12h后，在25℃与农杆菌黑暗条件共培养48h，共培养介质以微孔滤膜时转化效果最佳，转化效率可达到100-110个转化子/106个孢子。筛选用CM培养基所得到的转化子全为阳性，而以PDA为筛选培

6、养基得到部分为假阳性；共培养时光照无影响。转化子筛选菌落单孢分离转化子荧光观察gfp标记的新月弯孢DsRed标记的新月弯孢转化子分子检测MG1G2G3G4GFPR1R2R3R4DsRedClhyggfpDsRed荧光标记的新月弯孢菌株中hyg基因、gfp基因和DsRed基因的PCR检测2.3—4.6—9.4—23.0—ClG1G2G3G4R1R2R3R4kbSouthern杂交结果显示，大多数转化子为T-DNA单拷贝插入，且Southern杂交条带所处的位置各不相同，这说明T-DNA在基因组中的

7、插入位点不同，没有明显的位点插入偏好。转代四次后转化子稳定性分析三.转化子插入突变分析转化子的生长特性R1R2R3R4G1G2G3G4Cl转化子在CM培养基的菌落形态ABCDEFpH4.0pH5.5pH7.0pH8.5pH10.0pH11.5转化子R4、G2与野生菌株在PDA培养基的菌落直径测量酸性中性碱性转化子的产孢量、细胞壁降解酶产孢量纤维素降解酶果胶酶转化子的粗毒素、致病力ClR1R2R3R4G1G2G3G4ClR1R2R3R4G1G2G3G4CK转化子发酵液体培养基的滤液离体叶片针刺粗毒

8、素后的病斑症状菌株编号ClR1R2R3R4G1G2G3G4CK病情指数59.652.330.510.759.453.458.233.556.70转化子粗毒素产生的离体叶片病斑面积转化子接种5d后寄主的病情指数转化子插入位点分析转化子长度(bp)MaxscoreMaxident基因注释登录序列号R162710270%Pyrenophorateresf.teres0-1hypotheticalprotein,mRNAXM_003295948.1R279048277%Pyrenophoratritic