苹果树腐烂病菌的gfp标记及侵染部位与过程研究

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1、万方数据Developm。entofGFP—expressin·gStraresandInvestigatingtheInfectionSitesandProcesSofValsaceratospermaThesissubmittedt01nestsSUmlttetOQngdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeof—MasterofAgronomy1一一WangHaiyan(DepartmentofAgronomyan

2、dplantprotection)Supervisor：LiBaohuaandWangCaixiaQingdao．ChinaJune，2013万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。究生签名：珑私时间：秒f!年‘月2／名关于论

3、文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：导师签名：多髫扫弥丫时间：功唐年‘月∥日时间：沙B年‘月“日万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要苹果树腐烂病是由弱寄生茵Valsaceratosperma(TodeexFr．)Maire(syn．Val

4、samaliMiyabeetYamada)引起的一种毁灭性病害，可造成果树主枝、主干及整树死亡，甚至毁园。由于对于苹果树腐烂病菌的侵染、致病过程与致病机理尚不清楚，对该病害发生、流行特点和规律缺乏深入的了解，导致对该病害的防治工作低效、盲目和被动，腐烂病的危害近年来仍在逐年加重。为进一步明确苹果树腐烂病菌的致病机理，本研究建立了农杆菌介导转化(ATMT)腐烂病菌的技术体系，筛选出了生物学特性与野生型菌株相比没有显著差异的转化子菌株，为其组织学和流行学的研究提供了材料；通过组织学观察结合病害流行学的有关技术对病原

5、菌的潜伏部位、侵染位点和时期、影响病斑扩展的因素等进行了研究。具体结果如下：本研究利用ATMT技术，以腐烂病菌LXS080901的分生孢子为受体，以携带潮霉素B磷酸转移酶基因(hph)和绿色荧光蛋白表达基因(gtp)的二元载体priG—C为转化供体，农杆茵EHAl05菌株为转化介体，成功实现了对腐烂病菌的遗传转化。优化的腐烂病菌转化体系为：诱导培养基中添加2001xmol／mL乙酰丁香酮，腐烂病菌分生孢子浓度为106个／mE,，共培养温度和时间分别为25℃和120h，其转化效率可达121个转化子／皿。随机选取8

6、个转化子利用hph特异性引物进行PCR扩增，电泳检测结果显示所有转化子中均可扩增到987bp的特异性片段，表明T-DNA已经成功转化并整合到腐烂病菌基因组内。利用荧光显微镜对30个转化子的茵丝进行观察，发现96．7％的转化子可表达强的绿色荧光蛋白且遗传稳定性良好。利用Southernblot对8个转化子的T-DNA插入拷贝数进行测定，结果显示有5个转化子为单拷贝插入，3个转化子为双拷贝插入。对上述30个转化子的生物学特性进行了系统分析，与野生型茵槲目比，11个转化子的菌落形态发生了明显变化，表现为菌落颜色加深、

7、扇变、畸形等，6个菌株的生长速率明显减低；有6个转化子不能产生分生孢子器，但LXS080901．18转化子在菌丝中可观察到大量的分生孢子；致病性测定结果显示，70．0％的转化子致病力显著降低。此外，研究还发现LXS080901．2、LXS080901．9、LXS080901．15，3个转化子与野生型茵槲目比在茵丝生长速率、茵落形态、产孢能力及致病力等方面没有显著性差异。利用转化子LXS080901．15菌株接种言士枝条后制备超薄切片，可观察到转化子菌丝表达强的绿色荧光，这充分表明T-DNA插入转化子在接种植物组

8、织后咖蛋白仍可表达，为苹果树腐烂病菌的组织病理学研究奠定了基础。本研究对组织学观察中常用的10种染色剂进行了筛选，苯胺蓝、Hochest33258和万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要曲利苯兰对腐烂病菌菌丝的染色效果较理想，但前两者混合使用时效果更好，植物组织染色后为蓝色，而茵丝和细胞核为黄色。通过液氮冷冻、显微观察和组织分离等方法对对腐烂病菌的侵染潜伏部位进行了研究，结果表明，腐烂病