产纤维素酶细菌的筛选及培养.doc

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1、产纤维素酶细菌的筛选及培养一、筛选步骤1、菌种的采集采集山上距湿润的表层10cm处的土壤样本40g左右，用研钵研成粉末称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，加入99mL无菌水摇匀静置。2、菌种初筛（1）按照配方配制200mLCMC培养基，取1X250mL空锥形瓶和6X15mL试管，塞上棉塞并用报纸、棉线包扎，用报纸、棉线将试管包扎成一捆；取12套培养皿码齐包扎。将上述器材与培养基、无菌水121℃高压蒸汽灭菌20min。（2）于无菌台上倒9个CMC培养基备用。（3）另取6支15mL经灭菌的试管，用移液枪吸取土壤

2、溶液（上清液）1.000mL加入1号试管，加无菌水9.000mL。混匀后吸取1.000mL加入2号试管，重复上述操作，进行6次梯度稀释。（4）待CMC培养基冷却后，在超净工作台分别吸取104、105、106倍稀释液0.100mL于CMC培养基上稀释涂布，每种稀释液涂布三份。（5）将上述培养基置于37℃培养箱中培养24小时，标记菌落并记录各菌落形态（菌落高度、质地、颜色、气味、着生状态、边缘及表面纹理等）。（6）配制200mL刚果红家别培养基，与三套培养皿一起121℃灭菌20min。（7）在无菌操作台上倒3个鉴别培

3、养基备用。（8）将各菌落用牙签接种到冷却了的刚果红鉴别培养基上，37℃培养24h，挑选5株透明圈直径与菌落直径比最大的菌株进行摇瓶复筛。3、菌种复筛（1）配制500mL基础发酵培养基，分装到5只250mL的锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。（2）将初筛得到的菌株用接种环接种于液体培养基上（2环），37℃、150r/min下培养2—3天，转入4℃冰箱保藏。二、培养方法1清洗实验器具2灭菌3配培养基（纤维素作唯一能量源的培养基）4倒平板+选择培养原菌（可能会用摇床）5稀释菌样6涂布平板或平板划线7放入恒温箱（

4、调制均适宜的温度）12-24h，之后就可以收获细菌了8观察记录（数量、分布等）三、培养基种类及其组成1、初筛CMC培养基：CMC5g、蛋白胨1g、FeSO4·7H2O0.005g、NaCl0.25g、琼脂粉10g于1000mL锥形瓶中加蒸馏水至500mL、调节pH7．2～7．6，加棉塞121℃灭菌20min。刚果红培养基：(NH4)2S042g，MgS04·7H200.5g，K2HP041g，NaCl0.5g，微晶纤维素2g，刚果红0.4g，琼脂20g，加水至1000mL。无菌水：取1只1000mL的锥形瓶，各加

5、水1000mL，加棉塞与CMC培养基一起灭菌20min。另取1只250mL空锥形瓶、6支15mL试管和12套培养皿灭菌备用。2、复筛基础发酵培养基：羧甲基纤维素钠10g，蛋白胨10g，KH2PO419，MgSO40．29，Nacl10g水1000mL，pH调至7，121℃灭菌20min3、培养纤维素培养基:硫酸铵2.0g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1.0g，氯化钠0.5g，纤维素粉20.0g，刚果红0.2g，琼脂20.0g,在PH7.1，25℃条件下灭菌。宋扬生技12121220212206