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1、产纤维素酶霉菌的分离和筛选班级:09生物技术指导老师：黄志华组别:第五小组组员：吴志娟、戴剑鹤、柯佳宝、潘凯仑、王志辉（24-29号）组长：吴志娟一．实验目的1.进一步复习生物化学、微生物学等相关专业知识。2.掌握产纤维素酶细菌的筛选、纯化和保藏的方法。3.学会设计实验计划。4．综合培养动手操作能力及创新精神。二.实验原理纤维素（cellulose）作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源,探索纤维素资源的有效利用方法具有重要的意义。纤维素酶的来源很广泛，自然界中能产生纤维素酶的物种非常多。在过去的半个
2、世纪内，人们在各种原生动物、圆虫类、软体动物、甲壳类、昆虫、藻类、真菌类、细菌及放线菌中都发现了纤维素酶，近年来陆续在古菌中也发现很多纤维素酶的存在，但微生物是纤维素酶的主要来源，其中主要有真菌（霉菌）、细菌和放线菌。菌种采集:产纤维素酶霉菌的采集选择在纤维素含量较高的地方，如花园表层土壤、腐烂的木头、造纸厂废水及反刍动物的瘤胃及其排泄物等。本次实验拟从森林土中获得产酶菌株。采样的土层太深则厌氧菌占优，而浅层土受紫外线照射，细菌难以存活。故实验选取距表层土壤8cm处的土壤进行筛选。纤维素刚果红培养基筛选菌种的原理：通过刚果红鉴定板来鉴定产纤维素酶霉菌是一种快速简便的筛选方法,
3、透明圈直径和鉴定板孔径大小的比值能够直接反映该霉菌产纤维素酶的能力,其原理是刚果红是一种能够和大分子多糖相结合的染色剂,染色之后能和纤维素结合形成红色,产纤维素酶霉菌在培养基平板上培养后产的生纤维素酶将纤维素水解成葡萄糖和纤维二糖等小分子糖,在用刚果红染色之后没有被水解的纤维素能够和刚果红结合显红色,而水解的部位则不能和刚果红结合而出现透明圈。三．实验器材与试剂1.样品：后山植物林地土壤，于地下8cm左右。2.培养基：（1）富集培养基：配制查氏培养基的原料（硝酸钠2g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂
4、15~20g加水1000mL、pH自然）及链霉素。（2）分离培养基(CMC—Na培养基):羧甲基纤维素钠(CMC—Na)15g、NH4NO31g、酵母膏1g、MgSO40.5g、KH2SO41g、H2O1000ml，ph调节至7.0，121︒C灭菌25min。（3）斜面保藏培养基：硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂15~20g加水1000mL、pH自然及链霉素。（4）刚果红鉴别培养：羧甲基纤维素钠(CMC—Na)3.6g、(NH4)2S042g，MgS04·7H200．5g，KH2PO41g
5、，NaCl0．5g，刚果红0．4g，琼脂20g，加水至1000mL，pH调至7.0，121℃，灭菌20min3.器材：小铁铲和无菌纸或袋（可省）、培养皿6个、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、量筒、滴管、吸水纸、无菌水试管5支（每支4.5mL水）、烧杯3个、三角瓶5个、电炉、玻璃棒、接种环、镊子、恒温培养箱、高温灭菌锅、移液枪（枪头10个）、天平、滤纸、pH试纸等。四．实验步骤1.培养基的制备：霉菌分离、指示菌培养基都为查氏培养基。通过称量、加热溶解、调节pH等步骤，并配制50mL无菌水（内装几颗玻璃珠）2瓶4.5mL无菌水若干支。121℃灭菌20min后备用；另包扎好培养皿、
6、移液管和涂布棒等，灭菌，烘干备用。2.倒平板（涂布法）：将灭菌后的培养基冷却至50-60℃，以无菌操作法倒至经灭菌并烘干的培养皿中，每皿约20mL。为了防止非目的菌株的生长，可在真菌培养基中加入链霉素、青霉素等抗生素使之达到30㎎／L,以抑制细菌的生长，同时不干扰霉菌生长繁殖。冷却待用。3.微生物的分离（1）称取样品5g（液体样品5mL）放入装有45mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为10-1的土壤稀释液。（2）取4.5mL无菌水5支，用记号笔编上10¯2,10¯3,10¯4,10¯5,10¯6。（3）取10¯1的稀释液，振荡后静止2min,用无菌移液管吸取0.5mL上
7、层细胞悬液加至装有4.5mL无菌水的试管中，制成10-2稀释液。同法依次稀释至10¯3,10¯4,10¯5,10¯6的稀释液。在稀释过程中，因从高浓度到低浓度，每稀释一次应更换一支移液管。（4）另取移液管，分别以无菌操作法吸取10¯6，10¯5,10¯4,10¯3的稀释液0.1mL(依样品中微生物的多少选取不同的稀释度)，加至制备好的平板上，用无菌刮刀（涂布棒）涂布均匀。从低浓度到高浓度，可以用同一根移液管。（5）将培养皿倒置培养于恒温培养箱中，30℃培养3~5天后观察。若杂菌干扰不严重，可适当延长平板
