日粮能量水平对山羊瘤胃上皮细胞周期的影响.pdf

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1、江苏农业科学2014年第42卷第6期··——145-——卢劲晔，刘静，卢炜，等．日粮能量水平对山羊瘤胃上皮细胞周期的影响[J]．江苏农业科学，2014，42(6)：145—149日粮能量水平对山羊瘤胃上皮细胞周期的影响卢劲晔，刘静，卢炜，王锦锋，陆江，沈赞明(1．江苏农牧科技职业学院，江苏泰州225300；2．南京农业大学，江苏南京210095)摘要：选取l8只青年波杂山羊随机分成高能量组与低能量组，在细胞和分子水平阐述瘤胃上皮增殖及其机理。结果显示：高能量日粮提高山羊瘤胃上皮CyclinD1蛋白表达，加速细胞周期G期进程，促进细胞增

2、殖，加快瘤胃乳头生长，揭示了高能量日粮促进瘤胃乳头生长的细胞生物学机制。关键词：高能量日粮；山羊；瘤胃上皮；细胞周期；CyclinD1中图分类号：S827．5文献标志码：A文章编号：1002—1302(2014)06—0145—04瘤胃是反刍动物消化代谢、营养吸收最重要的场所之一，表1山羊日粮的组成成分瘤胃上皮吸收动物消化产生的能量、营养物质，瘤胃上皮的生长发育情况直接影响反刍动物的生产性能。提高动物日粮能日粮干能量水平可以促进山羊瘤胃上皮生长及山羊个体生长u。哺乳动物体细胞数量增多是通过加快细胞的有丝分裂来完成的，细胞从一次有丝分裂

3、结束开始到下一次有丝分裂完成所注：精料由玉米、豆粕、棉籽、麸皮、鱼粉、磷酸钙、微量元素、维生经历的整个有序过程称为细胞周期。细胞周期运行主要受细素组成。胞周期蛋白(eyelin)及细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的调控，细胞周期蛋白表达水平直接影响细胞有丝分裂的速聚合酶试剂盒(Fermentas公司)，引物设计与合成(Invitmgen率]。本研究探讨高能量日粮对山羊瘤胃上皮细胞周期以公司)，iQSYBRGreenSupermix(Bio—Rad公司)，蛋白提取及CDK的影响，旨在为提高山羊生产性能提供依据。试剂盒、BCA蛋白定量分析

4、试剂盒(北京博迈德科技发展有限公司)，ECL化学发光检测试剂盒(Pierce公司)，PVDF膜1材料与方法(Millipore公司)，兔抗CyelinD1多克隆抗体、小鼠抗甘油1．1材料醛～3一磷酸脱氢酶(Biowodd公司)，鼠抗CDK4单克隆抗体选用l8只青年波杂山羊(波尔山羊×淮南羊杂交山羊，(Abeam公司)。平均日龄为90d)作为试验对象。试验开始前，对山羊进行1．3流式细胞术测定山羊瘤胃上皮细胞周期驱虫，山羊自由饮水，采食花生秆，逐渐添加精料至400g／a，1．3．1瘤胃上皮细胞的分离与固定取约300nag组织块，适应期3

5、0d。试验正式开始后，根据体重相近原则，将山羊随用D—Hanks溶液(pH值为7．4，4倍双抗，37℃水浴预温)漂机分为高能量组(ME：1．00M]／(k’”·d)，约为维持水平的洗2～3次后，加0．25％胰酶15mL，37℃水浴，30min后弃2．0倍)及低能量组(ME：0．60MJ／(kg~·d)，约为维持水去消化液，取出瘤胃上皮组织，重复3次上述步骤。在处理后平的1．2倍)，高能量组及低能量组各9只山羊。所有山羊均的上皮组织中加D—Hanks溶液(pH值为7．4)清洗2次，继单圈饲养，自由饮水，采食花生秆，日粮营养组成见表1。高

6、续加入胰酶15mL消化10rain，1500r／rain离心10win，收集能量组山羊每天08：0o、11：00、14：00、17：00分别饲喂1次细胞。用PBS缓冲液(pH值为7．4)洗涤细胞沉淀2次，2mL100g精料(精料组成见表1)，持续饲喂42d，第43天屠宰预冷75％乙醇重悬细胞，混匀后4℃保存待测。取样。1．3．2碘化丙啶(PI)染色与流式细胞仪检测将用75％乙1．2主要试册醇固定的细胞用PBS缓冲液(pH值为7．4)洗涤2次以除去碘化丙啶(Sigma公司)，RNA酶抑制剂、随机引物、dNTP乙醇，再用5OPBS缓冲液(

7、pH值为7．4)重悬，加入(Promega公司)，RevertedM—MuLV反转录试剂盒、仡gDNA500PI染液，振荡混匀，室温避光染色15min，用流式细胞仪检测，每个样品计数10000个细胞，用CellQuest软件测定细胞大小及细胞DNA含量等数据。收稿日期：2013一o9—181．4RT—PCR法检测山羊瘤胃上皮细胞周期蛋白、蛋白激资助项目：国家自然科学基金(编号：30771568)；国家“973”计划(编酶mRNA号：2011CB1011801)1．4．1样品总RNA提取取约100nag瘤胃上皮组织，用手作者简介：卢劲晔

8、(1983一)，男，江苏扬州人，博士，讲师，主要从事动持电动匀浆机彻底匀浆后采用异硫氰酸胍一酚一氯仿一步法物营养生理研究。Tel：(0523)86853000；E—mail：leopardleo@163．com。提取瘤胃