基础生物学实验七教案

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1、徐州工程学院教案纸实验七PCR扩增技术一、目的与要求1.掌握聚合酶链式反应的原理。2.掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。二、实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是由美国PECetus公司的KaryMullis在1983年建立的。这项技术可在试管内经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过

2、程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在T

3、aq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。所以PCR产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。下列因素在实验应用时应予以特别注意，以求取得满意结果。1、模板：单、双链DNA和RNA都可以作为PCR样品，若起始材料徐州工程学院教案纸

4、是RNA，须先通过逆转录得取第一条cDNA。虽然PCR可以仅用极微量的样品，但为了保证反应的特异性，一般宜用ng量级的克隆DNA，ug级的染色体DNA，待扩增样品质量要求较低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，TaqDNA聚合酶的抑制剂以及能结合DNA的蛋白质。2、引物：引物是决定PCR结果的关键，下列原则有助于引物的合理设计。（1）尽可能选择碱基随机分布，GC含量类似于被扩增片段的引物，尽量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它异常序列的引物。（2）避免具有明显二级结构（尤其是在引物3"—末端）的序列。（3）防止引物间的互补，特别要注意避免具有3"末端重叠的序列。（4）引物的长度约为20个碱基，较长

5、引物较好，但成本增加，短引物则特异性降低。（5）引物浓度不宜偏高，过高易形成二聚体，而且扩增微量靶目标或起始材料是粗制品，容易产生非特异产物。3、缓冲液：PCR缓冲液的变化通常会影响扩增结果，特别是MgCl2，其浓度对专一性和扩增量有重大影响，通常最适浓度为1.5mM左右（每种dNTP的浓度为0.2mM时），浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物产量降低。四种dNTP浓度通常每种都是0.05mM—0.2mM。过高的浓度会导致错误掺入，浓度过低，则影响反应产物的产量。四种dNTP浓度应大体相同，其中一种若偏高，会诱发错误掺入，降低合成速度，过早终止延伸反应。另外dNTP能与Mg2+结合，使

6、游离Mg2+浓度降低，所以如果dNTP的浓度有很大改变，MgCl2浓度也要改变。Taq聚合酶是一种耐高温聚合酶，用量通常是1—4单位/100uL，浓度过高，产生过多的非特异片段。4、循环参数：PCR循环是把起始材料加热到90—95℃，保持短时间使双链DNA解链；然后冷却至37—55℃，使引物与模板退火；再升温至70—75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下掺入单核苷酸，使引物沿模板延伸。解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。用DNA扩增仪时，94℃保持1分钟可使模板的起始物完全变性。若用低于94℃的条件，则应适当延长时间。引物与模板退火温度由引物的长度及G+C含量决定。适时间退火（1—2）分钟有

7、利于产物的特异性。引物延伸在70—75℃保温的时间可根据扩增DNA片段的长短来调节。正常情况下，每分钟可延伸1Kb的长度，常规PCR一般为25—40个循环，若循环加长，则由于酶活性降低，聚合时间延长，引物及单核苷酸减少等原因，反应后期容易产生错误掺入，所以在满足产物得率前提下，应尽量减少周期次数。徐州工程学院教案纸三、实验试剂与器材模板DNA、2.5mmol/LdNTPTaqDNA聚合酶（5U/μ