二维阵列色谱分离系统及其在血浆蛋白质组中的应用.pdf

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1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)特约来稿第10期2015年10月ChineseJournalofAnalyticalChemist~1472～1478DOI：10．11895／j．issn．0253-3820．150400二维阵列色谱分离系统及其在血浆蛋白质组中的应用黄志邓楠晏国全高明霞梁振张丽华张祥民张玉奎(复旦大学化学系，生物医学研究院，上海200433)(中国科学院大连化学物理研究所分离分析化学重点实验室，大连116023)摘要本研究发展了在线二维阵列式液相色谱系统，对血浆蛋白质进行分离分析。在线二维阵列式液相色谱系统进行血浆样品的蛋白质水平分离

2、，整个分离过程仅需4h，并能进行高丰度蛋白质的快速定位。相比于高丰度蛋白质馏分的直接鉴定，经蛋白质均衡器材料富集后，鉴定得到的低丰度蛋白质数量提高了10倍，低丰度蛋白质的损失大幅度减少。本研究将二维阵列色谱分离系统对血浆样品进行完整的分离分析，共鉴定到了1474种蛋白质，蛋白质浓度动态范围达到了7个数量级。高丰度蛋白质馏分中共鉴定到252种蛋白质，其中有61种为高丰度蛋白质。结果表明，在线二维阵列式液相色谱系统实现了血浆样品中高丰度蛋白质的快速去除和高丰度蛋白质馏分中低丰度蛋白质的富集，显著提高了血浆蛋白质的鉴定能力，在其它复杂样品的分离分析中具有一定的应用前景

3、。关键词多维色谱；阵列色谱；高丰度蛋白质；蛋白质均衡器；血浆1引言在人类基因组计划完成后，生命科学研究领域进入了功能基因组时代⋯。血浆是临床医学中最为常用的检测样本，因而成为蛋白质组学研究的热点对象。但在血浆样品中，蛋白质的浓度分布超过l0个数量级，20种高丰度蛋白质的含量占总蛋白质的99％以上_2．3]。由于低丰度蛋白质在质谱鉴定中易受高丰度蛋白质掩盖效应的影响，因此必须对血浆样品中的高丰度蛋白质进行去除。以提高低丰度蛋白质的鉴定能力N,sl相较于免疫亲和柱去除高丰度蛋白质_6]，基于多维液相色谱去除高丰度蛋白质是一种通用型的样品预处理技术。一次运行可以去除数

4、十种未知的高丰度蛋白质“j。采用基于该技术原理的强阳离子交换色谱．反相高效液相色谱(SCX．RPLC)二维分离系统，成功对鼠肝样品进行了蛋白质水平的高效分离，一次性去除了58种高丰度蛋白质，鉴定得到的中低丰度蛋白质数提升了3倍¨l。本课题组最新构建的在线阵列式二维常规柱液相色谱系统．已成功应用于在蛋白质水平上进行血浆样品完整蛋白质的分离。大幅缩短了样品的全二维分离时间，对血浆样品中高丰度蛋白质的去除以及血浆样品的深入研究具有较高的应用潜力¨。无论采用何种高丰度蛋白质去除方法，在去除的高丰度蛋白质馏分中都会夹带一部分与高丰度蛋白质有相互作用的低丰度蛋白质。因此，从

5、高丰度蛋白质馏分中富集低丰度蛋白质仍是一个难题_l。蛋白质均衡器技术l】具有与各种蛋白质相互作用的能力和机会均等的特点，从而可降低馏分中高低丰度蛋白质的范围，实现低丰度蛋白质的富集。血浆样品经过蛋白质均衡器材料Ampholine@PM处理后，鉴定得到的蛋白质数目提高了1倍¨。本研究采用在线二维阵列式液相色谱系统对血浆样品进行蛋白质水平的分离，大幅缩短降低二维分离时间，实现高通量快速分离。针对低丰度蛋白质在质谱鉴定中易被高丰度蛋白质掩盖的问题，血浆样品在在线二维阵列式色谱分离时，对高丰度蛋白质进行了快速定位并将高丰度蛋白质馏分和低丰度蛋白质馏分分别进行后续处理。为

6、了进一步提高低丰度蛋白质的鉴定效果，采用均衡器材料进行高丰2015-05—15．收稿；2015-06-01接受本文系国家高技术研究发展计划(No．2012AA020202)，科技部基础研究计划项目(No．2012CB910604)，国家自然科学基金资助项目(Nos．21027002，21175026，21275034)资助E—mail：lihuazhang@dicp．ac．ca：xmzhang@fudan．edu．cn第10期黄志等：二维阵列色谱分离系统及其在血浆蛋白质组中的应用度蛋白质馏分中低丰度蛋白质的富集，为发现血浆蛋白质组中新的疾病诊断标志物和药物靶标蛋

7、白质提供更为简便和有潜力的技术方法。2实验部分2．1仪器与试剂二维阵列液相色谱系统(图1)在岛津2010A色谱系统(日本岛津科技公司)基础上进行构建。六通切换阀、十通电动顺序切换阀、三通、八通分流器均购于美国ValcoInstruments公司。第一维SAX柱ProPacTMSAX一10柱(250mmx4．0mm，10I,zm)与保护柱(10mmx4．0mm，10m)均购自美国Thermo公司；第二维阵列分离柱XtimateC8柱(250mm×2．1mm，5m，30nm，)与保护柱(10mm×2．1mm，5m，30nm)均购于上海月旭材料科技有限公司。馏分收集采

8、用ProbotLCPac