第八章 非线性色谱原理及其在蛋白质分离与纯化中的应用

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1、第八章非线性色谱原理及其在蛋白分离与纯化中的应用第一节概述色谱法起源于20世纪初，1906年俄国植物学家米哈伊尔·茨维特用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散为数条平行的色带。由于这一实验将混合的植物色素分离为不同的色带，因此茨维特将这种方法命名为Хроматография，这个单词最终被英语等拼音语言接受，成为色谱法的名称。汉语中的色谱也是对这个单词的意译。1952年马丁和詹姆斯提出用气体作为流动相进行色谱分离的

2、想法，他们用硅藻土吸附的硅酮油作为固定相，用氮气作为流动相分离了若干种小分子量挥发性有机酸。气相色谱的出现使色谱技术从最初的定性分离手段进一步演化为具有分离功能的定量测定手段，并且极大的刺激了色谱技术和理论的发展。相比于早期的液相色谱，以气体为流动相的色谱对设备的要求更高，这促进了色谱技术的机械化、标准化和自动化；气相色谱需要特殊和更灵敏的检测装置，这促进了检测器的开发；而气相色谱的标准化又使得色谱学理论得以形成色谱学理论中有着重要地位的塔板理论和VanDeemter方程，以及保留时间、保留指数、

3、峰宽等概念都是在研究气相色谱行为的过程中形成的。60年代，为了分离蛋白质、核酸等不易汽化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。60年代末科克兰、哈伯、荷瓦斯、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法（HPL

4、C）正式建立。在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。高效液相色谱同时还极大的刺激了固定相材料、检测技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。一、色谱法的基本特点1、分离效率高2、应用范围广3、操作参数多4、高灵敏度在线检测5、快速分离6、连续自动化操作1、分离效率高每米可达十几万个理论塔板，几个厘米的色谱柱就可以分离多组分的蛋白质混合物。2、应用范围广从极性到非极性，离子型到非离子

5、型，小分子到大分子，无极到有机及生活物资，以及其它热稳定或热不稳定的化合物，可以说无所不包。尤其是对生物样品的分离分析，是其他方法无法代替的。3、操作参数多流动相可以是气体、液体或超临界流体。各种流体中又有不同的物质可选用。固定相可用液、固两大类，每类中又有许多种可供选择。4、高灵敏度在线检测与其他分离手段相比，色谱具有高灵敏度在线检测的特性。有各种不同的检测器，适合于多种千差万别的样品需要。5、快速分离HPLC由于采用了高压溶剂传输系统，即使采用高效细颗粒填料，也能保证分离过程在一定的线速下进行

6、，而且由于柱效提高，更加快了分离速度。6、连续自动化操作电脑用于色谱分离过程以后，从最初的简单数据处理发展到目前作为控制操作的中心，使大量的样品可以按事先设置的程序进行完全自动连续的操作。二、线性色谱与非线性色谱线性和非线性是数学函数的概念，表示自变量与应变量之间的关系。在色谱学中，如果流动相中样品浓度Cm与固定相中样品的浓度Cs之间呈线性关系，那么在这种情况下的色谱分配过程就是线性色谱，即：Cs=KCmK为分配系数。Cm流动相中样品的浓度。Cs固定相中样品的浓度规律如果Cs和Cm之间不存在线性关

7、系，而是出现其他的函数关系，那么对应的色谱分离过程就称为非线性色谱。在实践过程中得知，当样品浓度很低时，Cs和Cm之间往往保持线性关系。在高浓度时Cs和Cm之间往往不出现线性关系。非线性和线性色谱行为的根本不同表现在以下几个方面1、样品的保留值可变。2、峰形不对称。3、色谱峰的峰高与浓度不是线性关系第二节非线性色谱理论基础非线性色谱理论是研究样品在固定相与流动相中的浓度处于非线性关系的状态下，各种实验参数对色谱分离过程的影响，建立起柱参数、溶质性质及操作条件之间的定量关系式。由于此时Cs与Cm不呈

8、线性关系，所以必须首先了解他们之间的函数关系，也既要研究吸附等温线及相应的吸附模型。一、吸附过程及吸附等温线吸附指一种通常发生在两相界面上的现象：处于界面上的分子或原子与其内部的分子或原子具有不同的能量与性质，产生了一种不平衡的倾向，造成界面的分子或原子数与内部不同，这种差异就形成了吸附现象。吸附过程主要分为两大类：化学吸附和物理吸附化学吸附热大，吸附过程往往是不可逆的，而物理吸附热小，吸附往往是可逆的。物理吸附与化学吸附产生物理吸附的作用力是分子间力,即范德华力.产生化学吸附的作