同位素内标超高效液相色谱-串联质谱法检测大鼠血清中丙烯酰胺和环氧丙酰胺.pdf

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1、第38卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报第10期2010年1O月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1487～1491DOI：10．3724／SP．J．1096．2010．01487同位素内标超高效液相色谱-串联质谱法检测大鼠血清中丙烯酰胺和环氧丙酰胺杨叶乔善磊陈景衡赵人垮敖淑清陆晓梅茅力“沈东旭练鸿振(南京医科大学公共卫生学院，南京210029)(生命分析化学教育部重点实验室，南京大学化学化工学院，南京大学现代分析中心，南京210093)摘要建立了检测大鼠血清中

2、丙烯酰胺和环氧丙酰胺的超高效液相色谱一串联质谱法(UPLC—MS／MS)。血清样品中加入乙腈沉淀蛋白质，超高速离心取上清液，离心浓缩后，采用ACQUITYUPLCT3C色谱柱(50mm×2．1mm，1．7m)，以0．1％甲酸溶液和甲醇为流动相进行梯度洗脱，经UPLC分离，电喷雾离子化四级杆串联质谱以正离子多反应监测方式(MRM)检测，用同位素内标法定量。丙烯酰胺和环氧丙酰胺在0．5～20．0mg／L浓度范围内线性良好，相关系数r均大于0．999；检出限均为0．1mg／L；在3个浓度水平(2．0，8．0，和1

3、5．0mg／L)进行添加实验，样品的加标回收率分别为98．0％～108．3％和99．6％～106．7％；日内精密度(RSD)为0．54％～5．8％和1．1％～5．8％；每个样品测试时间仅为6min。本方法测定大鼠血清中的丙烯酰胺和环氧丙酰胺操作简单快速，重现性好，灵敏度高。关键词丙烯酰胺；环氧丙酰胺；大鼠血清；超高效液相色谱一串联质谱法；同位素内标1引言丙烯酰胺(AA)分子中含有氨基和双链，化学性质相当活泼，是生产聚丙烯酰胺的工业原料。聚丙烯酰胺作为助凝剂用于净水处理。除职业接触外，人们可通过13常饮食(如

4、油炸薯片、薯条、高温烤的面包等)摄人大量的AA_1卫]。动物实验已经证实，AA具有神经毒性、发育毒性及动物致癌性，其对生殖损害作用也已被确认]。环氧丙酰胺(GA)是AA在细胞色素P4502E1的作用下氧化生成的，它被认为是AA的主要致癌活性代谢产物，，是一种神经毒素。生物材料中AA和GA的检测方法主要有HPLC法J、LC．MS／MS法o。等，但使用的色谱柱对AA的选择性不够。本实验采用改进的乙腈沉淀蛋白质的方法及对AA选择性的色谱柱，建立了测定雄性大鼠血清中AA和GA的超高效液相色谱．串联质谱法(UPLC．

5、MS／MS)，为AA、GA及其它代谢产物的雄性生殖毒理学研究提供实验依据。2实验部分2．1仪器与试剂WatersACQUITYUPLC超高效液相色谱仪、QuattroPrremin三重四极杆串联质谱仪、Masslynx4．1质谱工作站软件(美国Waters公司)；Allegra64R超高速离心机(美国Beckman—Coulter公司)；CentriVap真空离心浓缩仪(美国Labconco公司)；PURELABUltra纯水仪(英国ELGA公司)。AA标准品(99．5％，德国Dr．Ehrenstorfer

6、)；¨C3一AA标准储备液(99％，英国CambridgeIsotopeLaboratories，1．0g／L甲醇标准储备液)；GA标准品(98％)，”C3-GA标准品(97％)均购自加拿大TorontoResearchChemicals公司。AA试剂(动物灌胃用，99％，中国医药公司)；乙腈、甲醇、甲酸(HPLC级，德国Merck公司)；水为超纯水(ELGA纯水仪自制)。SD雄性大鼠l6只，体重(25±50)g，SPF级(上海斯莱克实验动物有限公司)。2010-01-08收稿；2010-05-06接受本文

7、系国家自然科学基金(No．90913012)、国家重点基础研究发展计划(No．2009CB421601)和南京医科大学科技发展基金重点项目(No．08NMUZ010)资助项目E—mail：maoli@njmu．edu．cn1488分析化学第38卷2．2UPLC-MS／MS分析条件表1梯度洗脱程序ACQUITYUPLCT3C18色谱柱(50mm×Table1Programofgradientelution2．1mm，1．7m，美国Waters公司)；柱温40oC；进样量1L；流动相A为0．1％(V／V)甲酸溶

8、液，流动相B为甲醇。梯度洗脱程序见表1。电喷雾离子源正离子模式(ESI+)；多反应监测(MRM)方式；毛细管电压：3．3kV；萃取锥孔电压4V；去溶剂气温度：400oC；源温度：105oC；脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气，流速分别为650和50IZh；碰撞气为高纯氩气，气压为31．4Pa。2．3空白血清和样品血清的制备4只雄性大鼠直接心脏取血，静置1h后以3000r／min离心15min，分离出空白血清，于一20c