同位素稀释-高效液相色谱-质谱联用技术检测大鼠血浆中的芥子气水解产物.pdf

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1、第40卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第10期2012年10月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1567～1572同位素稀释一高效液相色谱一质谱联用技术检测大鼠血浆中的芥子气水解产物李春正陈佳钟玉环钟玉绪谢剑炜李桦(军事医学科学院毒物药物研究所，北京100850)摘要应用同位素稀释一高效液相色谱一质谱联用技术(LC-MS／MS)，建立了同时定量检测血浆中芥子气水解代谢产物硫二甘醇(TDG)和二羟乙基亚砜(TDGO)的方法。应用甲醇和乙腈混合溶剂沉淀染毒大鼠血浆中蛋白，采用ZORBAX—C色谱柱(100mmX

2、3．0mm，3．5儿m)，以5mmol／L甲酸铵一甲醇梯度洗脱分离待测物。以d一TDG为内标，在正离子多反应监测模式下定性和定量分析TDG和TDGO。方法学验证结果表明，TDG在5～800g／L和TDGO在0．5～80．0g／L范围内均呈良好的线性关系(r>0．991)，定量限分别为5和0．5g／L，加标回收率在101％～118％之间，方法的日内和日间精密度(RSD)均小于10％。对SD大鼠(一6)采用皮下注射方式进行染毒后采样测定，代谢动力学参数计算结果显示，TDG和TDGO的达峰时间(t⋯)分别为30和60min，峰值浓度(c⋯)为(1724_+22

3、7)g／L和(301±115)g／L，血浆浓度一时间曲线下面积(AUC)为(3286_+249)g·h／L和(1010~363)g·h／L。关键词芥子气；硫二甘醇；二羟乙基亚砜；液质联用；血浆；毒代动力学1引言芥子气是一种强效的糜烂性毒剂，它在第一次世界大战中被迅速武器化，并在1917年应用于实战，随即被纳入了多国的化学武器储备。尽管芥子气进入战争时间较晚，但中毒造成的伤亡人数超过了其它所有类型毒剂的总和，最近一次确证使用发生在20世纪80代的两伊战争]。为制止化学武器对人类的危害，1997年正式生效的《化学武器公约》对化学武器的生产、使用、贮备及销毁作

4、出了详细规定，并针对已有的化学战剂、前体及有毒化学品进行了分类清单管理，芥子气作为最重要的化学战剂之一被列入清单一(Schedule1)嘲。二战结束后，侵华日军在我国领土上遗留了大量化学武器，芥子气是其中主要的填充战剂。这些遗留化学武器多被日军掩埋和藏匿弹体和容器腐蚀严重，毒剂泄漏已对我国环境和人民生命健康造成很大威胁，近年来因遗留化学武器引起的人员伤亡时有报道。芥子气暴露引起的损伤通常存在1～12h的无症状潜伏期，导致芥子气中毒诊断和治疗的延误，并由此产生严重后果，特别是对芥子气意外事故中的中毒人员。因此，建立准确、灵敏、快速的生物样品中芥子气及相关物

5、质的分析方法，实现早期中毒诊断是芥子气医学防治研究的重要内容。芥子气进入体内后可迅速发生水解／氧化反应，生成硫二甘醇(TDG)和二羟乙基亚砜(TDGO)等代谢产物(结构见图1)。在芥子气损伤人员的血液、尿、组织液及皮下组织中都可检测到TDG，尿样中的TDG和TDGO的浓度较高，且可以持续数日至一周[3]。美军《化学防护手册》已将TDG作为芥子气中O。llcl／＼／＼／＼clH0／＼／＼／^、、．oHHo／＼／＼／＼-0H图1芥子气及TDG和TDGO的化学结构Fig．1Chemicalstructuresofsulfurmustardanditshydro

6、lysis／oxidationproducts毒的临床诊断指标之一。目前报道TDG和TDGO的生物医学检测样本主要以尿样为主，检测技术以气相色谱一质谱联用法(GC—MS)为主。但GC—MS方法需先用TiC1，将TDGO还原为TDG，通过固相萃2012-03—12收稿；2012—05—15接受本工作系国家“重大新药创制”科技重大专项(2008ZXJ09006-001，2010ZXJ0900X-003—002)资助E—mail：amms_hli@126．com分析化学第40卷取等技术手段实现样品净化，再经过衍生化后，才可检测分析。该方法中样品前处理过程复杂繁

7、琐，耗时较长[8。相对于尿样，血浆样品则能够反映毒剂及其相关物质在血循环中的实时暴露水平，以及对严重中毒伤员具有采样及时方便等优点，因此，能够在芥子气暴露确证中提供更直接的证据。本研究基于高效液相色谱一串联四极杆质谱联用技术，应用稳定性同位素化合物为内标，实现了对TDGO的直接检测，建立并验证了同时测定血浆样品中TDG和TDGO的定量分析方法。本方法灵敏快速、操作简便、重现性好，可实时监测染毒大鼠血浆中芥子气暴露标志物TDG和TDGO的浓度，并成功应用于大鼠皮下染毒芥子气的毒物代谢动力学研究。2实验部分2．1仪器与试剂ACQUITYTM型超高效液相色谱仪

8、(UPLC，美国Waters公司)；QTrap5500型三重四极杆线性离子阱串联