通心络下调RAGE-MAPK信号通路拮抗AGEs诱导的人内皮祖细胞内皮分化异常.pdf

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1、中国中医基础医学杂志2014年8月第2O卷第8期1062ChineseJournalofBasicMedieineinTraditionalChineseMedicineAugust2014Vo1．20．No．8【实验研究】通心络下调RAGE-MAPK信号通路拮抗AGEs诱导的人内皮祖细胞内皮分化异常武双平，贺治青，袁国强，王永恒，梁春(1．河北以岭医院，石家庄050091；2．第二军医大学附属上海长征医院，上海200003)摘要：目的：观察通心络对晚期糖基化终产物(advancedglycatio

2、nendproducts，AGEs)诱导人内皮祖细胞(humanendothelialprogenitorcells，hEPCs)内皮分化的影响及其分子机制。方法：自健康人外周血体外培养hEPCs，给予AGEs和或不同浓度的通心络(tongxinluo，TXL)刺激，首先观察其对置于体外matfigel环境中hEPCs内皮分化的影响，随后针对相关的受体分子信号通路进行干预，明确上述信号通路哪些参与TXL的保护作用。结果：①单纯TXL刺激即可显著提高hEPCs的内皮分化水平，并呈一定的剂量依赖性；②与

3、AGEs刺激组比较，TXL干预并可显著改善AGEs导致的hEPCs内皮分化异常；③RAGE—MAPK通路介导了TXL的内皮分化保护作用。结论：TXL干预可通过下调RAGE—MAPK信号通路，显著改善AGEs介导的hEPCs内皮分化异常，这可能是TXL发挥其血管保护作用，特别是糖尿病病理环境下的重要机制之一。关键词：通心络；信号道路；内皮祖细胞；内皮分化；RAGE—MAPK中图分类号：R285．5文献标识码：B文章编号：1006-3250(2014)08-1062~3内皮祖细胞(humanendoth

4、elialprogenitorcells，1．2外周血hEPCs的分离培养和鉴定hEPCs)作为内源性血管修复的重要介导细胞’，取健康志愿者外周血50ml，经密度差异离心分其作用和调控分化等生理特性一直是人们研究的热离外周血单个核细胞，种植于预先包被人纤连蛋白的点，从他汀类药物的促hEPCs动员到在体捕获10cm大皿中，给予EGM2培养基培养，培养21d后hEPCs促进支架内再内皮化的新型支架系统的问可见hEPCs呈鹅软石样增殖，分别通过FITC标记荆世，无不彰显hEPCs在动脉粥样硬化相关血管病豆

5、凝集素I(FITC—UEA．I)和Dil标记的乙酰化低密度变损伤后修复的重要作用，但在糖尿病等病理环境脂蛋白Dil．ac—LDL以及流式细胞鉴定其纯度。中hEPCs的功能和状态发生改变。我们前期的研1．3晚期糖基化终产物制备究证实，糖尿病的重要致病因素——晚期糖基化终取人血清白蛋白，将其按照1mg／ml浓度与葡产物(advancedglycationendproducts，AGEs)可通萄糖溶液混匀后共置于37℃细胞孵箱中，按照文献过激活RAGE—MAPK信号通路导致hEPCs功能异报告共孵育60d

6、，孵育结束后通过过夜透析方法去常，上述病理作用可部分被通心络(tongxinluo，除葡萄糖，并经超滤浓缩分装于一80℃冰箱备用。TXL)所阻断。而现有大量研究证据提示，除了自身1．4干预分组增殖、迁移和分泌功能，内皮分化是其hEPCs介导分为对照组、AGEs干预组(200g／m1)、TXL内源性血管修复的另一重要生理基础。因此，本干预组(250、500、750I~g／ml，溶于DMSO中，并经鲎研究旨在观察TXL对AGEs诱导的hEPCs内皮分实验内毒素检测阴性)、TXL预先干预30min后再化异

7、常的保护作用及其相关分子机制。给予AGEs刺激组、RAGE过表达+TXL+AGEs干1材料与方法预组以及MAPK信号通路激动剂(预先激动3O1．1主要试剂和材料min)+TXL+AGEs干预组。通心络超微粉由石家庄以岭药业公司提供；淋1．5hEPCs过表达RAGE巴细胞分离液、FITC标记荆豆凝集素(FITC—UEA—使用Accutase酶(美国ebioscience公司)消化1)及MAPK信号通路激动剂购自美国Sigma公司；贴壁细胞，将其与携带GFP荧光标记的过表达蛇皮透析膜、超滤管、Accut

8、ase酶和人纤连蛋白均购RAGE受体的质粒以及配套核电转试剂混匀，按照自美国Millipore公司；RAGE抗体、Taqman荧光探仪器使用说明经Nucleofector核电转仪(德国amaxa针、定量PCR试剂、胎牛血清和Dil标记的乙酰化低公司)转染，转染3d后经流式细胞仪鉴定转染效密度脂蛋白(Dil—acLDL)购自美国Life公司；内毒素率，同时蛋白电泳分析RAGE过表达水平。检测鲎试剂购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司；流1．6hEPCs的体外内皮分化评估式细胞