电镜样品的基本制备技术之负染色技术.ppt

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1、第五章电镜样品的基本制备第二节负染色技术负染色又称阴性反差染色，它是利用高密度的、且在透射电镜下又显示结构的重金属盐（如磷钨酸、醋酸铀等），把生物标本包围起来、在黑暗的背景上显示出呈现阴性反差样品的微细结构。所以负染色所显示的电镜图像，正好与超薄切片正染色相反，其样品结构为透明浅色，而背底则为无结构的灰色或黑色。对于负染色的机制，目前还不够清楚。负染色技术首先，由Ha11（1955）、Hux1ey（1957）等人所采用，在后来的生物学研究中得到了越来越广泛的应用。负染色样品不需经过固定、脱水、包埋和超薄切片等复杂操作，而是直接对沉降

2、的样品匀浆悬浮液进行染色。与超薄切片技术相比，该技术具有操作简便、用药量极少、省时快速及分辨力高等优点，现广泛用于细菌、病毒、大分子结构、亚细胞碎片及分离的细胞器等研究工作。特别是在病毒学领域，负染色更能发挥其独到作用，是一项很重要的实验技术。—、负染样品的制备负染色所用的样品，全部取自悬浮液。在这种悬浮液中样品必须达到一定的浓度和纯度，这样才能与染色剂之间产生特异和清晰的结合反应。操作时，将带有样品的悬液，滴于带有支持膜的铜网上，染色处理后即可进行电镜观察。其全部制备过程分述于下。（—）浓缩取样法适用于病毒等微细颗粒的浓缩处理。１

3、．红细胞吸附法主要用于粘液病毒和副粘液病毒的制备。其操作方法为：将病毒悬液与等量红细胞混合，放置5分钟，使病毒吸附于红细胞表面；而后，以800转／分速度低速离心15分钟，使吸附有大量病毒的红细胞沉于管底；最后，弃去上清液，加入少量生理盐水，于室温下或冰箱中存放3～4小时，病毒即可从红细胞表面释放到上面的溶液里，取溶液滴在铜网载膜上，进行后染色处理。2．低渗释放法从培养瓶中刮下所培养的腺病毒或疱疹病毒，低速离心，弁上清液，于沉淀物中加入培养液与蒸馏水的混合液（比例为1：4），使细胞因低渗破裂而释放出病毒，然后快速冻融数次，再将冻融后的

4、悬液低速离心，取其上清液滴膜染色。3．抗体病毒凝集沉淀法某些病毒如鼻病毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒及甲、乙型肝炎抗原等，可于相应的抗体形成病毒一抗体复合物，经离心沉淀而浓缩，而后取浓缩的沉淀物滴膜染色，可找到较多的病毒。目前这一技术已广泛用于病毒疾病的快速诊断。（二）直接取样法对于某些皮肤病毒性疱疹（如天花、水痘及疱疹等）可用毛细吸管直接刺入疱疹中取样，再将吸管中的泡液滴在带有支持膜的铜网上，待稍干后立即染色观察。此法主要用于临床快速诊断．对于生长在固体培养基上的微生物，可用白金环刮取，再用缓冲生理盐水稀释成悬液，即可滴样，待稍干

5、后染色观察。对于生长在琼脂板上的噬菌体斑，也可采用直接取样法。（三）离心提纯法用于细菌、病毒、噬菌体等微生物或细胞匀浆中线粒体、微管等细胞器的提纯。先用低速离心（3000转／分），弃去较大杂质和细胞碎片．再用适当孔径的滤膜过滤，其滤液再经低温超速离心，最后取沉淀物制成悬液滴样染色。二、染液的配制一般均由重金属盐配制。最常用的有磷钨酸（PTA）、磷钨酸钾（KPT）、磷钨酸钠（NaPT）、醋酸钠、甲酸钠和钼酸铵等。当使用磷钨酸或磷钨酸盐时，可用蒸馏水或磷酸缓冲液配制成0.5％～3％的溶液，染色前应用：１N的氢氧化钠或氢氧化钾将pH值调到

6、6.4－7.0。醋酸铀则用0.2～0.5％水液．pH为4.5～5.5，染液在用前新鲜配制，盐溶解需20～30分钟。钼酸铵配制成2～3％溶液，使用时用醋酸铵将pH调至7.0～7.4之间。作为负染色剂的条件：（l）具有较高的电子密度和较强的电子散射能力；（2）耐受电子束的轰击、在电子束照射下不升华；（3）在电镜下不呈现染色剂本身的结构；（4）化学稳定性好，不析出沉淀，与样品不发生化学反应，易在不规则样品表面渗透。三、负染色操作方法（—）滴染法将制备好的悬浮液样品,用毛细吸管吸取，滴于带有支持膜的铜网上。根据悬液内样品的浓度,立即或放置数

7、分钟后，用滤纸从液珠边缘吸去多余液体，即可滴上染液，染色时间1～2分钟．而后即可用滤纸吸去染液，待干燥后即可电镜观察。注意事项：　　　　　　　　　　　　　　（l）操作时吸管不能离铜网太近，应让液滴离开吸管后自然滴下，否则液滴易将铜网吸起；（2）支持膜应完好无损，吸管不能太粗，液滴不能太大，否则都不能形成良好的液珠；（3）病毒在液滴的边缘分布较多，操作时不宜用滤纸吸干，而任其自然稍干后再加染液。（二）漂浮法先将样品悬浮液滴在干燥的载玻片上，再把带有支持膜的铜网放在悬浮液的液珠上漂浮以沾取样品；然后，用滤纸吸干铜网上的多余悬液，再将铜网

8、在染液滴珠上漂浮，时间１－2分钟，最后再用滤纸将染液吸干即可观察。四、影响负染效果的有关因素（—）掌握染色时机染色应在铜网上的悬液将要干燥而又没完全干燥时进行，如果铜网上的悬液残留较多或完全干燥后染色，则严重影响染色效果，便得不到理想