分子生物实验复习题2.doc

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1、实验三PCR产物的电泳、回收目的基因的连接、转化实验内容1.PCR产物的电泳、回收；2.PCR产物与T载体的连接3.感受态细胞的制备；4.连接产物的转化；5.铺制LB培养平版；6.涂菌培养过夜。一、PCR产物的电泳及回收1）PCR产物电泳：15ul产物+3ul上样液1%琼脂糖凝胶，100伏，30分钟。2）PCR产物的回收（挤胶法）（1）在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的琼脂糖凝胶切下，放入封口膜中；（2）将切下来的胶块，标记好姓名，-20℃冰箱中。（3）放在封口膜内直接挤压，用加样器吸取挤压后得到的液体。常见回收方法介绍1、冻融

2、法：1） 在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的琼脂糖凝胶切下,-70oC冷冻至少15min。2） 在65oC水浴中使胶融化，加入等倍体积TE-饱合酚,剧烈振荡30秒钟，然后-70oC冷冻15min。3） 室温融化后，12,000´rpm离心5min，将上层水相移至另一管中，用2.5倍体积乙醇和0.1倍体积3mol/LNaAc(pH5.2)沉淀、漂洗和干燥DNA。2、挤胶法（1）在UV灯下，用手术刀片将含DNA片段的琼脂糖凝胶切下，放入小离心管中；（2）将切下来的胶块，-70oC冷冻15min；（3）放在封口膜内直接挤压，用加样器吸

3、取挤压后得到的液体。3、回收试剂盒（商业化）。回收后鉴定1） 当回收的片段是用于与载体的连接，准确判断回收片段的DNA含量是非常重要的。将回收得到的片段进行电泳分析，通过与DNAMarker条带的比较，可以粗略判断回收片段的量，为连接反应估计加入多少目的基因片段提供参考，可增加连接效率。2）如何在胶上估计DNA的含量：DNAmarker参比法。（50ng/5ul）电泳样本：Marker5ul、T载体1ul、回收片段。电泳后通过判断电泳样品的亮度，大致判断连接片段和载体的比例。二、PCR产物与T载体的连接T载体一般是从公司购买的，因此

4、，载体DNA的含量和浓度是已知的。连接反应成败的关键是估计目的DNA的量。可按下列配方进行连接反应：回收的DNA片段7mlT载体1mlT4DNA连接酶buffer1mlT4DNAligase1ml终体积10ml轻弹管底混合，离心机甩一下，置25oC水浴1~2h。连接产物可以直接用于转化，也可以置-20oC保存备用。（低温连接效果比室温好）TA克隆原理1、TagDNA聚合酶的一个功能：使PCR产物的3`端突出一个A。3`AA3`5`5`2、商业设计的T载体：在3`端多出一个T。3`TT3`5`5`3、两者的粘性末端可以互补配对。PCR

5、产物3`末断带有单个A，T载体是线性化DNA，其末端具有不配对的T，PCR产物与T载体是粘性末端连接，互补碱基先退火结合，然后连接酶在缺口形成磷酸二酯键。应用时避免反复冻融，防止T的断裂丢失。如果与T载体连接后主要以自身环化为主，要考虑T可能已经丢失。其他说明：1）连接反应的关键是目的基因片段与载体的比例，一般片段与载体比例为2:1或3:1（摩尔比），根据片段大小决定比例。2）平端连接平端连接通常需要先将载体的5¢端磷酸去掉，然后再进行连接，这样可以防止载体的自身环化。当载体的5¢端磷酸去掉后，片段与载体的连接就会留下一个缺口，连接

6、酶由于载体5¢端缺乏磷酸而无法形成磷酸二酯键，转化入细胞后，细胞内的酶会将缺乏的磷酸基团加上，再形成磷酸二酯键。三、感受态细胞的制备感受态细胞制备原理培养至对数生长期的大肠杆菌在低渗CaCl2存在的情况下，细菌变得膨胀而易于外源基因的导入。另外，钙离子溶液处理的细胞对外源DNA的摄取能力增强。说明：1）感受态细胞的膜已经很脆，应该超低温保存。如果反复冻融会使细胞活力受影响，而且细胞膜的变化可能复原，由感受态细胞状态回转到普通细胞状态，失去接受外源DNA的能力。2）无菌操作。在火焰附近操作，火焰附近是无菌区。各种器具均需消毒。感受态细

7、胞的制备1）将大肠杆菌在LB琼脂培养基上划线，置37oC12-16小时。2）次日从琼脂平板上取一单菌落，于2mlLB培养基中，37oC，225rpm速度震荡培养12-16小时。3）取1ml上述培养物接种于100mlLB培养基中，37oC，225rpm的速度震荡培养直至OD值为0.5左右(约3小时)。4） 取1ml菌液冰浴5min，然后6000rpm，离心5min，收集菌体。5）弃上清，除净剩余液体，然后加入100ul冰冷的100mmol/LCaCl2致敏液悬浮细胞，冰浴5分钟。6）6000rpm，离心5分钟，回收细胞，弃上清，加入1

8、00ul冰冷100mmol/LCaCl2溶液，悬浮细胞。7）4oC可保存1-2周；长期保存，可加甘油至终浓度为15%，置-70oC备用。LB培养基琼脂平板的制备蛋白胨：10g酵母提取物：5gNaCl：10g琼脂：15g蒸馏水：800m