分子生物实验讲义

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1、分子生物学实验课程讲义总学时：3216周学时：2适用年级专业：生物技术2011级生物科学2010级开课时间：2012－2013学年第2学期授课教师姓名：胡凯目录实验一基因组DNA的提取实验二基因组DNA的纯化实验三DNA的琼脂糖电泳检测实验四DNA的琼脂糖回收实验五PCR基因的扩增实验六质粒DNA的提取实验七核酸的荧光定量检验实验八大肠杆菌的感受态细胞制备实验九大肠杆菌的质粒转化实验一基因组总DNA的提取一、实验目的与原理简介：抽提的DNA可用于PCR、Southernblotting、DNA文

2、库构建等操作。细胞中DNA主要存在于细胞核内，称核DNA或染色体DNA，DNA约为109bp，如此细长的分子对任何机械力的作用都十分敏感。在DNA提取过程中，DNA分子的降解很难避免，因此提取得到的只是DNA分子的片段。DNA的提取常用的有以下两种方法：SDS（十二烷基硫酸钠）法：高浓度的SDS在较高温度下（55-65度）裂解细胞，破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来，通过酚和氯仿抽提去除蛋白质、脂质、多糖等，通过RNaseA消化去除RNA，最后用乙醇沉淀DNA。该法操作简便，能满足大多数实验

3、需要。CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）法：CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜并能与核酸形成复合物，该复合物在高盐浓度（0.7mol/LNaCl）中是可溶的，通过离心就可将复合物同变性的蛋白质、多酚、多糖杂质（沉淀项）去除，水相中含有核酸与CTAB的复合物及其它可溶性的杂质，直接向水相中加入预冷的异丙醇则导致核酸的沉淀，CTAB和其它多数杂质留于异丙醇与水的混合相中，分离DNA沉淀并经75％乙醇漂洗后溶于TE（或纯水）得到DNA的粗提物。用于精细PCR、Southern杂交和DNA文库构建的DNA则应

4、进一步纯化。用RNase水解RNA，用酚：氯仿：异戊醇和氯仿：异戊醇抽提去蛋白杂质等，经乙醇沉淀后可获得较为纯净的植物总DNA。该法可以通过高盐缓冲液的选择型沉淀能很好的去除材料中的多酚及糖类杂质，得率高，质量好，用于PCR、Southern杂交、分子标记、DNA文库构建等。二、实验准备：SDS提取液：100mMTris-HCl(PH8.0)2.5%(V:V)巯基乙醇500mMNaCl20mMEDTA1.5%SDSCTAB抽提液：2%（w/v）CTAB100mmol/LTris-HCl(pH8.0)

5、20mmol/LEDTA(pH8.0)1.4mol/LNaCl醋酸钠：3mol/LNaAc用冰乙酸调pH值至4.8-5.2。TE溶液：100mmol/LTris-HCl1.00mmol/LEDTA调pH值至8.0。为防止Dnase的降解作用，提取使用的各种器具及溶液均应经过高压灭菌。三、实验步骤CTAB法DNA的粗提1、加入250mg土壤、730μl提取缓冲液、70μl裂解液和600mg0.1mm玻璃珠到2ml离心管中，70℃水浴10min。2、加入使用Tissrelyser(10min20Hz,2

6、次或者10min25Hz,1次)。3、裂解管离心14000g×1分钟,转移上清(约600ul)到新管，加入300ul腐植酸吸附剂和200ul10M乙酸铵，室温放置5min，离心14000g×5分钟，将上清液转移到一个新的1.5ml离心管中。【如样品中腐殖酸含量高，溶液颜色较深，可加入腐殖酸吸附剂再处理一次】4、冷至室温后加入等体积(5ml)氯仿：异戊醇（24：1），轻柔颠倒混匀使乳化10min；10000转／分离心10min（18-20℃）；5、吸取上清于另一干净的2ml离心管中；　　　　　　　注：

7、根据需要可用氯仿：异戊醇如上法重复抽提一次；吸取上清时一定不要打破沉淀层6、吸取上清加入与上清液等体积（约4至5ml）且已于-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置15分钟至白色絮状沉淀出现；注：若没有沉淀出现，则加入上清液1/5至1/10体积的pH4.8-5.2的3MNaAc,混匀，于－20℃冰箱中沉淀30min；5、10000转／分离心10min（18-20℃）；弃上清，用75%乙醇中漂洗DNA沉淀，用Tip头吸干乙醇；6、用1ml75%乙醇再漂洗一次；7、用无水乙醇再漂洗一次；10.沉淀于室温

8、或60℃以下的恒温箱中干燥片刻至刚出现半透明；用100μlTE溶解沉淀，可用65℃水浴助溶，得DNA粗提物，可用于PCR等。实验二基因组DNA的纯化一、实验目的与原理简介在分子生物学实验中，我们粗提取的ＤＮＡ需分离纯化去处蛋白质、多糖、腐殖酸等杂质，才能获得纯度高的DNA样品完成后续实验。同时通过紫外分光光度计测定OD260,OD280的吸收值，以确定DNA的浓度和纯度纯化方法通常有醇沉淀、硅胶膜吸附、磁珠法等。硅胶膜在高盐（如4M盐酸胍）低PH（如PH5.0-6.5