分子生物学实验讲义

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1、《生化与分子生物学》实验讲义天津医科大学生物医学工程系2005年-77-实验一自抗凝血中提取哺乳动物细胞基因组DNA一、实验目的1、了解核酸的基本特性。2、掌握DNA提取和鉴定的方法。二、实验原理核酸的分离与提取是分子生物学研究中很重要的基本技术，核酸样品的质量可能直接关系到后续实验的成败。核酸包括DNA、RNA两种分子，在真核细胞中都是以与蛋白质相结合的状态存在（DNA与组蛋白形成核小体，再折叠缠绕成染色体），真核生物基因组DNA为双链线性分子，存在于细胞核内。基因组DNA的提取需经过DNA的释放（破膜）、DNA与

2、蛋白质的分离，DNA的沉淀等过程。分离纯化核酸的总原则：1、保证核酸一级结构的（核苷酸序列）的完整性，全部的遗传信息均储存在一级结构中。2、排除其它分子的污染。a)对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。b)生物大分子：蛋白质、多糖和脂质。c)其它核酸分子：RNA.三、实验试剂1、TKM缓冲液10mmol/LTris-HClpH7.6（Tris三羟甲基氨基甲烷）10mmol/LKCl2mmol/LEDTA4mmol/LMgCl22、TE缓冲液-77-10mmol/LTris-HCl1mmol/LEDTApH8.

3、03、10％SDS4、饱和氯化钠四、实验步骤1、取0.5mlEDTA抗凝的全血于清洁的1.5mlEppendorf离心管中。2、加入0.5mlTKM缓冲液，13μlTritonX-100（终浓度为1.2％），颠倒混匀。在台式离心机上离心，5,000rpm×10分钟。（低渗破红细胞膜）。3、倾去上清液，在离心管中加入1.0mlTKM缓冲液，混匀后离心，5,000rpm×10分钟，重复步骤3两次。（清洗）4、于沉淀中加入200μlTKM缓冲液和15μl10％SDS（终浓度为0.7％），混匀后于55℃保温20分钟。（破白细

4、胞膜）注：此步中可加入少量蛋白酶K。5、于离心管中加入75μl饱和（≈6mol/L）氯化钠溶液（终浓度为1.2mol/L），混匀。13,000rpm离心5分钟。（沉淀蛋白质）6、小心吸取上清液约240μl转移至另一洁净的1.5mlEppendorf离心管中。加入750μl95％的冷乙醇（终浓度为71％），－80℃放置30min。离心1,5000rpm×20分钟，最好在4℃。（沉淀DNA）7、小心吸去上清，加入1.0ml75％的冷乙醇，洗涤沉淀，相同条件再离心一次。（脱盐）8、弃去上清，用Parafilm膜封口，在膜上

5、扎孔后置37℃温箱中干燥，以去除残余的乙醇。9、将干燥后的DNA溶于50μlTE缓冲液中，置－20℃冰箱中备用；也可将干品置－20℃冰箱中备用，使用前用30μl重蒸水溶解。10、OD260/OD280的测定。五、注意事项为保证核酸分离的完整性和纯度，实验过程中应注意以下事宜：-77-1、量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。2、少化学因素对核酸的降解，避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏。3、减少物理因素的核酸的降解，如机械剪切力（强力高速的震荡）、高温（破坏化学键，常规操作温度为0－4℃，可降低

6、核酸酶的活性，减少核酸的生物降解）。4、防止核酸的生物降解，核酸酶消化磷酸二酯键，破坏一级结构。其中DNA酶，需要二价金属离子的激活（Mg2＋），使用二价金属离子鳌合剂EDTA，基本上可抑制DNA酶的活性。-77-实验二聚合酶链式反应及DNA的琼脂糖凝胶电泳一、实验目的1、掌握PCR反应的原理，学习PCR的方法，熟悉PCR扩增仪的使用。2、了解PCR反应条件的优化及引物设计。3、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作方法。二、实验原理聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction，PCR）是KarryMullis于

7、1985年创立的一种通过体外酶促扩增获取大量特异DNA片段的方法。PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应，模拟天然DNA的复制机制。PCR的特异性取决于引物和模板的特异性结合。PCR的全过程是以变性、退火、延伸三步反应为一周期，通过若干轮的循环完成的，其中每一步的转换是通过改变反应温度来控制。1、变性（denaturation）模板DNA在95℃左右的高温条件下双链间的氢键断裂，双链DNA解链成为单链DNA并游离于反应液中。2、退火（annea

8、ling）热变性后将温度降低，人工合成的两个寡核苷酸引物分别与模板DNA扩增区域的两端准确配对结合，形成局部杂交链。3、延伸（extension）在四种dNTP底物及Mg2＋存在的条件下，DNA聚合酶在最适作用温度下可将脱氧单核苷酸从引物3’端掺入，并沿着模板以新合成的DNA单链的5’→3’方向延伸合成新DNA，以上三个步骤为一循环，每一循环的