分子生物学技术综合实验讲义

《分子生物学技术综合实验讲义》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、研究生分子生物学实验江西农业大学理学学院2005年11月13说明本实验讲义主要是为了加强我校研究生分子生物学实验技能、提高我校研究生培养质量而编写的。实验内容选择了一系列常用分子生物学实验技术，并设计成为一套彼此连贯、前后呼应的综合实验。实验分成两个部分：前一部分是DNA的操作，主要是DNA片段的亚克隆的方法；后一部分是蛋白的操作，主要是目标蛋白的表达与纯化。实验讲义主要参考了魏群主编的《分子生物学实验指导》，而在实质内容上，DNA操作部分更多的是参考了萨姆布鲁克等人的《基因克隆》第二版的中译本。某些部分同时补充编者平日工作经验的积累。希望同学们能够珍惜这次机会，认真地完成每项实验，真正地掌

2、握些实实在在的实验操作技能，为今后的学习和工作打下基础。生物学的成就主要是通过实验实现的，希望在自己的实验学习过程中多思索与观察，多动手，注重实验技能的培养和提高，江西农业大学理学院王义华2005年11月13目录实验一、大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA转化1实验二、质粒DNA的提取3实验三、DNA琼脂糖凝胶电泳5实验四、植物总DNA的SDS法提取7实验五、蛋白质的诱导表达及SDS-PAGE电泳鉴定9附录：二种常用试剂贮液的配制1313实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化[实验原理]细菌感受态是指细菌处于容易吸收外源DNA的状态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。C

3、aCl2法制备感受态其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收外源DNA复合物，如质粒DNA。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，吸收了外源DNA复合物细菌细胞获得的新的表型如氨苄青霉素(Amp)和卡那霉素(Kan)抗性等,并得以表达。然后再涂布于选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。[仪器、材料与试剂](一)仪器1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．-20℃冰箱5．恒温水浴器(二)材料1．卡那霉素或

4、氨苄霉素2．大肠杆菌DH5a3．质粒DNA(Kan抗性)4．1.5l离心管5．移液枪、枪头6．试管、培养皿(三)试剂1．LB培养液在950ml去离子水中加入：胰蛋白胨(tryptone)10g酵母提取物(yeastextract)5gNaCl10g摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。2．卡那霉素(Kan)，用无菌水配制成100mg／ml溶液，置-20℃冰箱保存。3．CaCl2溶液100mMCaCl24．CaCl2-甘油溶液：100mMCaCl220～25％甘油13[实验步骤]感受态制备：1．挑取E.ColiDH5a单菌

5、落接种于5ml液体LB培养基中，37℃培养过夜。2．取500ml菌液加到50mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2～3h，至O.D.为0.3-0.5，冰浴30min。3．4,000×g，4℃离心3min，收集菌体。4．用预冷的10mlCaCl2溶液悬浮菌体，冰浴20～30min。5．4,000×g4℃离心3min收集菌体，用预冷的2mlCaCl2-甘油溶液重悬。6．置于冰浴中备用（12～24h内转化效率最高），以每管200μl7．分装于1.5ml离心管中，液氮速冻后，-70℃保存备用。转化1．新鲜制备的或-20℃下保存的200ml感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。2．加入

6、1mL质粒DNA，轻轻混匀。3．冰上放置30分钟。4．42℃水浴热激60秒。5．冰上放置2分钟。6．加800mlLB培养液，37℃250rpm/分振荡培养30分钟。7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉800ml上清液。8．重悬后，吸取50ml细菌液涂布在Kan/LB琼脂平板上。9．平皿在37℃下正向放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。10．对照的制作：在上述步骤中不加入质粒DNA，其它步骤操作相同。[实验结果]经37℃培养过夜的、在卡那霉素/LB琼脂平板上出现的菌落即为质粒DNA转化的大肠杆菌。计数菌落总数，计算制备的感受态菌的转化效率，以每mg质粒DNA转

7、化的菌落数表示。13实验二质粒DNA的提取[实验原理]碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA两条互补链