14级博士分子生物学实验技术讲义

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1、博士研究生分子生物学实验技术讲义浙江中医学院生命科学学院目录实验一、质粒的提取及纯化实验二、DNA琼脂糖凝胶电泳实验三、质粒的酶切及电泳实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验五、PCR扩增及电泳实验六、目的片段的回收实验七、哺乳动物组织基因组DNA的提取实验八、哺乳动物组织总RNA的提取c实验九、RT-PCR实验十、植物基因组DNA提取实验十一、Sourthern杂交附录一、目的片断的回收实验一质粒的提取及纯化小量法提取（碱变性裂解法）一、实验目的用碱性SDS方法快速从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒DNA，进行琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙啶染色，在紫外灯下检测。通过

2、本实验，学习和掌握质粒的快速提取纯化、技术。二、实验原理从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多，其分离的依据可利用分子大小不同，碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。碱变性法抽提效果良好，既经济且得率较高。抽取到的质粒DNA可用于酶切、连接与转化。对于分子量较大拷贝较少的质粒DNA，由于DNA片段较大易于损伤断裂，因此选用氯化铯密度梯度超离心法抽提DNA，具有纯度高，步骤少，方法稳定且获得的质粒DNA是超螺旋构型等特点。对于高拷贝数质粒，用小量制备法抽提质粒DNA就有足够量可用于基因操作。碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DN

3、A的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。本实验就是利用碱变性法抽提大肠杆菌中的质粒。三、仪器、材料与试剂(一)仪器1、恒温培养箱2、恒温摇床3、台式离心机4、高压灭菌锅5、制冰机6、电

4、泳槽及电泳仪7、紫外观测仪8、漩涡振荡器(二)材料1、三羟甲基氨基甲烷（Tris）2、乙二胺四乙酸（EDTA）3、氢氧化钠4、十二烷基硫酸纳（SDS）5、乙酸钾6、冰乙酸7、氯仿8、乙醇9、RNA酶（RNase）10、苄青霉素（Amp）(三)试剂1LB培养液：10g氯化钠10g蛋白胨5g酵母提取物补充蒸馏水到990ml,用5NNaOH调至pH7.0补充蒸馏水到1000ml,120℃高压灭菌30min2氨苄青霉素：50mg/ml溶于水3氯霉素：34mg/ml溶于乙醇4溴化乙锭：10mg/ml溶于水5溶液150mmol/lTris.clPH7.5;10mmol/lEDT

5、APH8.0分别加入下列溶液，定容至100ml,高压灭菌后，存于4℃1mol/lTris.cl(PH7.5)5ml0.5mol/lEDTA(PH8.0)2ml6溶液II0.4MNaOH；2%SDS（现用现配），不能高压灭菌。使用时0.4MNaOH和2%SDS等体积混合使用，使其工作浓度为0.2MNaOH和1%SDS7溶液III1.32mol/lKac(PH4.8)分别加入乙酸钾12.96g，溶于双蒸水80ml，用HAc调节pH至4.8，定容至100ml，灭菌后存于4℃备用。8TE缓冲液10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0),高压灭菌。四

6、：实验步骤1、在两只50ml离心管中分别加入10ml含有60ug/ul氨苄的LB培养液，从两块转化平板上分别挑取单菌落接种于其中，37℃振荡培养过夜。2、在1.5ml离心管中加入菌液1.5ml，12000g离心2min，收集细菌沉淀，倒掉上清。3、将细菌沉淀中加入预冷的溶液I200ul，剧烈震荡将菌液充分混匀。4、加溶液II200ul（NaOH和SDS用之前等体积混匀），盖严管盖颠倒微型离心管5次以合内容物，温和震荡，至溶液变的澄清，冰浴放置5min。（根据不同菌株可适当缩短）5、溶液澄清后加入预冷的溶液III200ul，温和混匀10s，冰上放置3-5min。6、1

7、2000g4℃离心5min，取上清移至一个新的Eppendorf管中。7、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），震荡混匀，12000g，4℃下离心5min，取上清移至另一个Eppendorf管中，用来去除杂蛋白。8、加入2倍体积无水乙醇（室温），震荡混匀，室温放置5min。9、12000g，离心5min，弃上清。10、加500ul的70%乙醇洗脱，直接倒去70%乙醇，再离心30秒，将管壁上的乙醇收集至管壁，用枪头吸去。室温下蒸发痕量的乙醇10—15min。11、最后加入50ul的双蒸水或TE（含Rnase20ug/ml）溶液溶解，37℃水浴，30min