三叶半夏凝集素C端结构域的可溶表达及其活性研究.pdf

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1、浙江理工大学学报(自然科学版)，第31卷，第4期，2014年7月JournalofZhejiangSci—TechUniversity(NaturalSciences)Vo1．31，No．4。Ju1．2014文章编号：1673—3851(2014)04—0439—06三叶半夏凝集素C端结构域的可溶表达及其活性研究许韶威。刘冰颖，周炜，高永，杨支力。吕正兵，徐涛(浙江理工大学a．生命科学学院生物工程研究所；b．启新学院；C．生命科学学院生物化学研究所，杭州310018)摘要：利用pET-32SUMO表达载体在大肠杆菌中可溶表达三叶半夏凝集素C端结构域(P_D2)

2、，并研究其凝血活性、糖结合特异性以及肿瘤抑制活性。实验结果表明，P-D2蛋白的产量为5mg／L。该蛋白具有凝集小鼠红细胞的活性，可以被I)I甘露聚糖抑制，但不能被I)_乳糖、【)_葡萄糖、I)_麦芽糖抑制。P—D2蛋白的体外抗肿瘤活性实验表明其对肝癌细胞Bel-7404以及结肠癌细胞SW-620都有良好的抑制作用。凋亡现象观察实验发现P-D2蛋白可以诱导癌细胞Bel一7404的凋亡。这是首次在大肠杆菌表达系统中表达了可溶的半夏凝集素c端结构域，为其他凝集素的可溶表达提供了新的选择。关键词：P-D2；凝血活性；SUM0；Hochest染色；抗肿瘤活性中图分类号：

3、Q816文献标志码：A的小分子泛素样修饰蛋白，在调节如RNA转录、蛋0引言白的核质运输等多种生理活动中起着重要作用l_9_。凝集素是一类广泛存在于动植物中，可以特异有报道指出，一些难表达的蛋白可通过使用SUMO性结合糖基的非免疫来源的糖蛋白或者蛋白[1≈]。融合表达系统成功地表达¨1。SUMO能增加重组凝集素这种糖结合特异性的能力，不仅赋予了凝集蛋白溶解性，促进其正确折叠l_1，且SUMO蛋白酶素凝血_1]、抗肿瘤l3]、杀虫等生理特性，也使得其在可以高效无损切开融合蛋白，并不影响表达的蛋白现代生物研究中有很多的应用。如探索癌变过程中的活性。这使得SUMO融合

4、表达系统在蛋白表达癌细胞表面的糖蛋白变化[-1]，或者与一些生物素、荧领域应用越来越广泛。光素、纳米颗粒等结合，可用于电镜或光镜水平的免半夏凝集素是由两个相同的N端结构域和两疫细胞学研究[5]等。半夏凝集素(PTA)是从中药个相同的C端结构域组成的同源二聚体[7]。本研半夏块茎中分离得到的一种活性蛋白l_6]，可以凝集究首次采用人源SUMO融合表达系统成功地表达兔血细胞、鼠血细胞，但不能凝集人血细胞[7]，对多了可溶的三叶半夏凝集素C端结构域(P-D2)。这种肿瘤细胞如卵巢癌、结肠癌、肝癌等都有比较好的是首次表达获得了可溶的三叶半夏凝集素C端结抑制效果，是一类

5、发展前景比较好的潜在抗肿瘤药构域。物。在以往的凝集素表达研究中，研究者选用了原1材料与方法核表达系统以及家蚕杆状病毒表达系统成功地表达了半夏凝集素[2舟]，但仍存在表达产物为包涵体、纯1．1实验材料化不易、表达周期过长、不适宜工业化生产等问题。PCR所需的试剂(Taq聚合酶、MgCI2、10×SUMO(smallubiquitinrelatedmodifier，小泛buffer、DNTP)、SanPrep柱式系列试剂盒(PCR产素相关修饰物)是一类广泛的存在各种真核细胞中物纯化试剂盒、胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂收稿日期：2O13—12—17基金项目：国家自

6、然科学基金资助项目(30772712)，大学生创新项目(201310338122)作者简介：许韶威(1988一)，男，浙江衢州人，硕士研究生，研究方向为天然药物化学。通信作者：徐涛，电子邮箱：pkuxt@aliyun．tom440浙江理工大学学报(自然科学版)2014年第3l卷盒)、限制性内切酶(BamHI和NotI)、IPTG、酵1．2．4P-D2蛋白凝血活性实验以及糖结合特异性母提取物、蛋白胨、SDPAGE所需试剂、Ni—NTA实验SefinoseTMResin等均购自上海生工。pEasyT1-凝血活性实验参照Luol_1所示的方法。终浓pta质粒存储于浙

7、江理工大学生物工程研究所。质度为2、4、6、8、10fg／mLP-D2蛋白溶液分别与适粒pET一32一SUMO以及SUM()蛋白酶由浙江理工量的准备好的小鼠红细胞混匀，静置1h后，在倒置大学生物化学研究所王涛惠赠。其他所需未提及的显微镜下观察实验结果。对照组则加入等量的试剂和耗材均购自杭州兰堡生物有限公司。PBS。1．2实验方法糖结合特异性实验参照Zhou~3所示的方法。l_2．1融合蛋白表达载体pET一32一SUMO-D2的选用的糖类为【)I甘露聚糖、D--~L糖、I)I葡萄糖、【)I麦构建与鉴定芽糖。以质粒pEasyT1一pta(由本实验室构建，半夏凝1．

8、2．5P—D2蛋白的体外抗肿瘤活性集素