猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及免疫原性初步研究.pdf

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1、·258·疾病防治中国畜牧兽医2014年第4l卷第4期猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及免疫原性初步研究尹秀凤，丁美娟，张海涛，秦进进，孙龚，许秀梅，汪爱芬，张小飞，薛家宾(南京天邦生物科技有限公司，江苏南京211102)摘要：采集浙江某猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑、脾脏等组织病料，经PCR检测为猪伪狂犬病病毒(pseudorabiesvi—rUS，PRV)野毒感染，用BHK一21细胞进行病毒的分离培养，结果显示该病毒能引起典型的细胞病变，第4代病毒液毒价达10。TCID。／mI；PCR和动物回归试验结果表明该分离株为P

2、RV，并将其命名为PRVZJ株。将第4代病毒液制备成油乳剂灭活苗，免疫2kg左右家兔，免疫后28d采血并攻毒，测定其免疫原性，结果显示血清中和指数为13490。保护率为100。本试验结果表明PRVZJ株有很好的免疫原性，为进一步开展疫苗研究奠定基础。关键词：猪伪狂犬病病毒；分离鉴定；灭活疫苗；免疫原性中图分类号：$852．65文献标识码：A文章编号：1671—7236(2014)04025804猪伪狂犬病(pseudorabies，PR)是一种由伪狂邦生物科技有限公司生物技术研究所保存；脑、脾脏犬病病毒(pseud

3、orabiesvirus，PRV)引起的高死亡等病料采自浙江某猪场疑似PR的哺乳仔猪，置于率、急性传染病，主要引起哺乳仔猪急性死亡，表现一20℃冰柜保存备用；PR基因缺失疫苗毒Bartha—神经症状、麻痹、衰竭死亡为特征，死亡率高达K61株(gE／gI双基因缺失)由南京天邦生物科技100；还可导致妊娠母猪流产、产死胎和木乃伊胎。有限公司弱毒活疫苗车间提供。该病对全球的养猪业造成了巨大的经济损失，仅次1．1．2试验动物及主要试剂2kg左右家兔由南于猪瘟和口蹄疫(蔺芳等，2009)。国内普遍采用京天邦生物科技有限公司试

4、验动物基地提供。PRV毒力基因缺失疫苗预防本病，但近年来不断有DMEM培养基、新生牛血清、胰酶均购自Gibco公PR发生的报道，由于疫苗多为基因缺失株，就为该司；DL2000DNAMarker、Taq聚合酶、dNTP、微量病的鉴别诊断提供便利，但多数报道只局限于诊断，病毒DNA／RNA提取试剂盒均购自TaKaRa公司；而未进行更深一步的研究。gD基因是PRV中最Marcol52白油佐剂由南京天邦生物科技有限公司主要的免疫糖蛋白编码基因，gD糖蛋白是PRV最灭活疫苗车间提供。主要的免疫原性蛋白之一；gE基因是PRV的

5、一个1．2方法毒力基因，是病毒复制的非必需基因，编码的gE糖1．2．1病料的处理采集适量病猪的脑、脾脏等组蛋白是所有野毒株均能表达的一类糖蛋白。本研究织，置于研钵中，加入液氮研磨，用生理盐水10倍稀选择gD和gE基因作为研究对象，旨在确定该猪释成组织悬液，反复冻融3次，12000r／rain离心场是否为PRV野毒感染发病。10min，取上清，用0．22m针头滤器过滤除菌，于2013年2月，浙江省某猪场哺乳仔猪出现神经一20℃保存备用。症状，发病后大量死亡。据临床症状及病理变化，初1．2．2引物的设计与合成据GenB

6、ank中公布的步诊断为PR，采集发病仔猪的脑、脾脏等组织病PRV多个分离株的gD和gE基因的序列，设计2料，利用BHK一21细胞进行PRV的分离培养，灭活对特异性引物。gD基因引物序列为：gD—F：5一后与油乳剂乳化研制成了安全、有免疫原性的PRGGGAATTCCCGTTGTGGCTCA3，gD—R：5一灭活疫苗，旨在为今后PR疫苗的研制奠定基础。CCCAAGCTTACCCCAAGTCCGCC一3；gE基因1材料与方法引物序列为：gE—F：5，_AGGCcCCGAGCCAGAG—1．1材料GCGGC一3，gE—R：

7、5GAAGGCGTCGACGGCA—1．1．1细胞、病料与毒株BHK一21细胞由南京天GTCCGC一3，扩增片段大小分别为650和950bp。收稿日期：2Ol31O—O8引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，作者简介：尹秀凤(1975)，女，山东人，硕士，研究方向：动物传用无菌水稀释成适当浓度，贮存于-20℃冰箱备用。染病预防。1．2．3病料组织中DNA提取及PCR检测、序列通信作者：张小飞。E—mail：xiaoIei0804@sina．corn基金项目：江苏省科技成果转化专项资金项目(BA2010021

8、)。分析取1．2．1的临床样品组织悬液200L用于中国裔牧兽医2014年第41卷第4期疾病防治·259·DNA的提取。采用微量病毒DNA／RNA提取试剂2结果与分析盒提取DNA，作为PCR反应模板，分别扩增gD和2．1病料组织的PCR扩增和序列分析通过对病gE基因片段。PCR反应体系25t,I：10×PCR料提取DNA进行常规PCR，病料组织和PR基因Buf