总自由基快检测试剂盒-脱细胞彗星实验.doc

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1、总自由基快速检测试剂盒-脱细胞彗星实验研究背景:自由基可攻击DNA的碱基和脱氧核糖发生化学变化,引起碱基改变、破坏或脱落形成碱性不稳定位点，脱氧核糖分解，同时自由基也可直接导致DNA单链或双链的断裂。因大部分自由基均可损伤脱细胞DNA，因此检测DNA损伤可反映自由基总体水平。脱细胞DNA检测自由基始于上世纪80年代，已经用于代谢后产生的自由基和环境诱发自由基的检测。如N-二烷基亚硝胺类化学物经紫外线A照射后产生自由基，导致脱细胞DNA单链断裂、DNA氧化损伤标志物（8-羟基-鸟嘌呤脱氧核苷酸）增加。Rossner

2、等利用脱细胞DNA成功地检测到室内空气污染物引起的DNA氧化损伤。多环芳烃类（PAH）化学物经过体外活化后产生的自由基导致脱细胞DNA氧化损伤增加。声明：本产品为自主专利产品，独家销售！未经授权不得销售。请按试剂序号依次排放！！！需自备：无水乙醇，电泳仪，电泳槽，吸头（本试剂盒不需要3和4号试剂）脱细胞彗星实验（AC-COMET）SOP实验步骤试剂号1.受试物代谢(需要代谢活化的受试物)：用S9+受试物（参照S9活化说明书）2.受试物稀释：取受试物/或代谢活化产物用染毒缓冲液稀释。①染毒缓冲液(2×)1.染毒：把

3、稀释后的受试物滴加在脱细胞-核DNA上（避光操作），在适当温度下（推荐首选4℃2个小时，再选室温1个小时，也可37℃半小时）②脱细胞-核DNA（DNA已经断裂为短片段）2.漂洗：从裂解液中取出载玻片,在蒸馏水中洗去过多的盐（2次5min/次）。3.解旋：把载玻片置于水平电泳槽中,倒入新配制的电泳缓冲液(把电泳液的⑤A、⑤B瓶倒入烧杯定容至1000ml,ｐＨ≥13),使液面高于载玻片2ｍｍ,避光解旋30ｍｉｎ。⑤A解旋电泳液一⑤B解旋电泳液二4.电泳：调节电压为25Ｖ（有效电泳长度1V/ml）,电流300ｍＡ,室温

4、下电泳30ｍｉｎ。5.漂洗：电泳完毕,取出载玻片,用中和缓冲液漂洗3次，每次5ｍ⑥中和缓冲液(5×)6.脱水：冷存乙醇脱水10min，常温放置。7.染色：然后滴加50μｇ/ml荧光染料60μｌ成像，然后用专业软件分析。⑦荧光染料本公司有自主专利产品：高通量彗星电泳平台-现货在售彗星智能分析软件（CometA1.0）-现货在售欢迎订购。