免疫组化、HE染色步骤.doc

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1、骨组织石蜡切片制作步骤：1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓冲液内固定12—24h。2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h.3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I1小时，石蜡II1小时。6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水

2、中展片，然后用干净的载玻片捞片。7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。免疫组化检测步骤：1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min二甲苯1（10min）二甲苯2（10min）。2.水化：100%酒精1（2min）100%酒精（2min）95%酒精（2min）80%酒精（2min）70%酒精(2min)。3.PBS冲洗3次，每次5min.。4.抗原修复：将组织片置0.01M的柠檬酸缓冲液（PH6.0）中煮沸15min,自然冷却至室温。5.PBS冲洗3次，每次5min。6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活性。7.PBS冲洗3次，每次5min

3、。8.滴加1抗（GFP1：100稀释,4℃过夜）9.PBS冲洗3次，每次5min。10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min,PBS冲洗3次，每次5min。11.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min,PBS冲洗3次，每次5min。12.DAB显色5min。13.自来水冲洗10min。14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。15.自来水冲洗10min。16.常规脱水，透明，封片，镜检。组织切片HE染色步骤1、将烘烤后的组织切片依次侵入二甲苯1，二甲苯II进行脱蜡各10min。2、脱蜡后的组织切片依次浸入无水乙醇I、无水乙醇II、95%酒精、80%酒精、

4、70%酒精中各2min，PBS冲洗2次，每次5min。3、苏木素染色3min,自来水冲洗3min,1%盐酸酒精分色2s，自来水冲洗2min,依次浸入50%、70%、80%的酒精中各2min,伊红浸泡5s，自来水冲洗3min。4、再将组织切片依次侵入95%酒精、无水乙醇I、无水乙醇II中各3min，最后再依次侵入二甲苯I,二甲苯II各5min。5.中性树胶封片，镜检。