he石蜡切片步骤,免疫组化步骤

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1、HE染色1．取材切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以6mm×6mm×5mm为宜。注意事项：（1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选，尽可能不要损伤所需要的部分。2．固定将切好的组织用生理盐水组织洗3次，立即投入10%中性福尔马林固定液或4%多聚甲醛中固定，固定36小时。注意事项：（1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。（2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。（3）固定

2、材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。（4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。脱钙72小时中间不换液是样本30倍中杉金桥（进口脱钙液）镊子触质粒由硬变韧性为准。（美）：固定3-5天根据组织大小确定天数，越大固定时间越长。3.洗涤材料经固定后,PBS或双蒸水冲洗约3小时。（20，30，30，60）（美）：流水冲洗约4小时4.脱水材料依次经80%、90%、100%、1

3、00%各级乙醇溶液脱水，各30min注意事项：（1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。（2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。（3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。（4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。（5）如需过夜，应停留在80%酒精中。（6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象（美）：80％的酒精×2小时95％的酒精×2小时100％的酒精×2小时×2100％的

4、酒精×1小时或者更长时间5．透明（环保透明脱蜡液）中杉金桥纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ60min、Ⅱ30min（至透明为止）。由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。透明注意事项（1）使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。（2）更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。（3）在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。（美）：二甲苯2小时

5、二甲苯2小时二甲苯2小时6．透蜡放入二甲苯和石蜡各半的混合液60min，再放入石蜡Ⅰ60分钟、石蜡Ⅱ透蜡30分钟。透蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织大小而定。透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55-60℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。一般置于恒温箱0.5h。透蜡注意事项（1）尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度；（2）透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；（3）操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。（美）：石蜡2小时石蜡2小时石蜡2小时7.包埋包埋时，用镊

6、子夹取石蜡模子（金属质地）在酒精灯上稍加热，放在平的桌面上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入少许石蜡。再将镊子稍加热，夹取材料将切面朝下放入蜡模中，排列整齐。再放上包埋盒，轻轻倒入熔蜡。8.切片①将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。②将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。③摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4-10微米。⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-50r/min。⑦

7、切成的蜡带到20-30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。⑧用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。⑨切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。9.展片、贴片打开水浴锅，使水温维持在40-45℃，另准备30%乙醇溶液。②切片时，将一碗30%乙醇溶液放于切片机旁的桌面上。②用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在乙醇溶液的水面上，使切片展开