免疫组化 HE染色 FISH ISH.ppt

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1、现阶段开展的病理实验主要内容：免疫组化HE染色几种特殊的染色原位杂交荧光原位杂交免疫组化1、免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。2、我们现阶段主要要做的组织免疫组化有石蜡切片、冰冻切片免疫组化以及荧光免疫组化。细胞免疫组化有细胞爬片、细胞印片和细胞涂片免疫组化和荧光免疫组化。3、免疫组化过程中抗原修复有高压修复法、酶修复、微波修复，其中微波修复抗原对提高免疫组化阳性检出率非常

2、有效。4、高压修复和微波修复法中常用的缓冲液有0.01M柠檬酸缓冲液、1mM的EDTA（pH8.0）。6、酶标抗体系统中的酶与显色剂、复染液的合理选用：（1）辣根过氧化物酶系统（HRP）显色剂一般用DAB、AEC,DAB显色液一般染色部位为棕黄色，AEC显色液一般染色部位为红色；而HRP系统常用的复染液为苏木素，将细胞核染成蓝色。（2）碱性磷酸酶系统（AP）显色剂一般用BCIP/NBT、固红、固蓝。最常用的是BCIP/NBT显色液，染色部位为深蓝色或者蓝紫色；该系统常用的复染液为核固红，将细胞核染成红色。免疫组化切片组织前期处理1、

3、组织块大小应限于2cm×1.5cm×0.2cm。2、应用于光镜的免疫组织化学染色的切片厚度一般要求5μm左右，神经组织的研究要求切片厚度在20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。3、石蜡切片为常规制片技术，切片厚度2～7μm，应用范围广，不影响抗体的穿透性，染色均匀一致。4、组织的固定：4%多聚甲醛固定一般1-2小时。固定后经充分的流水冲洗后进行脱水包埋。5、组织脱水：主要用不同梯度的酒精进行脱水。一般情况下，组织经过70％，80％，90％，95％，以至无水酒精的脱水程序，即可达到脱水的要求。但是为了能使大量的组织块同时进行脱水

4、，则要求保持液体的浓度以保证脱水的作用，最好是以两次95％酒精，两次100％酒精重复进行脱水，以保证组织的水分脱净。6、组织透明：我们一般采用二甲苯透明，30-60min即可。5、石蜡切片：浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60℃以下，以熔点低的软蜡较好,浸蜡时间1－4小时。6、冰冻切片：组织采用液氮法包埋。将未固定的组织放入OCT包埋剂中对组织进行液氮包埋，包埋后放在-80度冰箱中贮存或者对其进行切片。或者将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量，再放入OCT包埋剂中进行包埋。7、切片的固定：

5、冰冻切片、细胞切片常用固定液为4℃丙酮或者4%多聚甲醛，固定10-30min。石蜡切片免疫组化1、石蜡切片脱蜡至水。2、3%H2O2室温孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶的活性，水洗，5min×3次。3、根据客户抗体要求进行修复，PBS冲洗，2min×3次。4、5-10%正常山羊血清封闭（5%BSA封闭20-30min），室温孵育20-30min。倾去血清，勿洗。5、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液（PBS配制），37℃孵育1-2小时或4℃过夜。（室温20-30min，再放于37℃孵育20-30min）6、PBS冲洗，2m

6、in×3次。7、滴加适当比例稀释的生物素标记二抗，37℃孵育10-30min。8、PBS冲洗，2min×3次。9、滴加即用型SABC，37℃孵育10-30minPBS冲洗，5min×4次。10、显色剂显色（DAB或AEC）。11、自来水充分冲洗，复染（苏木素），脱水透明，封片。返回B石蜡切片免疫组化DAB显色血涂片，细胞，冰冻切片免疫组化1、冰冻切片4-8µm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存于-20℃冰箱。2、室温放置30min后，放入4℃丙酮或者4%多聚甲醛固定10-30min。PBS冲洗5m

7、in×3次。3、30%过氧化氢1份+纯甲醇50份混合，室温浸泡30min，以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗2次。4、其余步骤和石蜡切片免疫组化4-11步相同。注：如果冰冻切片直接染色结果不理想时，可以参照石蜡切片对切片进行热修复，方法和石蜡切片3-11步相同。石蜡切片荧光免疫组化1、石蜡切片脱蜡至水。2、与石蜡切片免疫组化3-8的步骤相同。3、加入SABC-FITC,37℃孵育10-30min，PBS冲洗，5min×4次。4、抗荧光萃灭封片液封片，荧光显微镜观察。冰冻切片荧光免疫组化1、冰冻切片4-8µm，冰冻切片后如不染色，必须吹

8、干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存于-20℃冰箱。2、室温放置30min后，放入4℃丙酮或者4%多聚甲醛固定10-30min。PBS冲洗5min×3次。3、5-10%正常山羊血清封闭，室温孵育10-30min。倾去血清，勿洗。