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《小鼠CD1d2编码区基因克隆及鉴定.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、小鼠CDld2编码区基因克隆及鉴定【摘要】目的：克隆小鼠CDld2编码区基因。方法：提取小鼠胸腺组织总RNA,用RT-PCR技术扩增CDld2cDNA,PCR产物连接pGEM-T载体，转化大肠杆菌，用限制性酶切反应和DNA测序对阳性克隆进行鉴定，用BLAST软件进行序列分析。结果：扩增出一条特异DNA条带，DNA序列测定表明获取了大小为1008bp的小鼠CDld2基因编码区基因。结论：成功克隆了小鼠CDld2编码区基因。【关键词】小鼠；CDld2；基因；克隆；鉴定文章编号:1009-5519(2008)07-0953-02中图分类号：R392
2、文献标识码：ACloningandidentificationofthegeneencodingmouseCDld2CHENZhang-quan,HUANGZhen,LIANGXiao-dong(DepartmentofClinicalImmunology,GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524023,China)[Abstract]Objective：ToclonethegeneencodingmouseCDld2(mCDld2).Methods：TotalRNAwasextractedfromthethy
3、mustissue,mCDld2wasamplifiedbyRT-PCRandwasclonedintopGEM~Tvector,whichwassubsequentlytranfomedintoE.ColiDH5a,theinsertionofgeneandtherecombinantplasmidwereidentifiedbyrestrictenzymedigestionandDNAsequencing.Results：AspecificDNAbandwasseenbyagroseelectrophoresis,theresultoft
4、heDNAsequencingshowedthatthemCDld2codingregeiongeneof1008bpwasobtained.Conclusion:ThemCDld2codingregeiongeneclonedsuccessfully,whichlaidthefoundationsforfurtherresearchonthefunctionofmouseCDld2.[KeywordsjMouse；CDld2；Gene；Clone；IdentificationCDl分子的结构与MHC-I类分子，但它是独立于MHC分子之外的一
5、类特殊的抗原提呈分子，主要提呈脂质分子，也称为第三类抗原提呈分子[HoCDl分子分为CD1-I和CD1-II两组，前者包括CDla.CDlb、CDlc和CDle等四类分子，后者只有CDld分子，其中人CDld分子只有一种存在形式[1],而鼠CDld分子却有两种存在形式即CDldl和CDld2,二者的同源性达95%[1,2]。本课题组正在进行基于NKT细胞为靶点的抗肿瘤活性物质的筛选研究，这些活物质是通过CDld分子提呈给NKT细胞识别后发挥作用[1],后续工作需以小鼠为动物模型进行相关的功能研究。人CDld分子与鼠CDldl分子的功能相似[3
6、],而CDld2的功能却尚不清楚。为此，我们进行了小鼠CDld2基因克隆，以便进一步研究其生物学功能。1材料和方法1.1材料：昆明种小鼠由广东医学院动物中心提供。RNA提取试剂为Invitrogen公司产品。反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶及PCR产物纯化试剂为QiaGen公司产品。pGEM-T-Eeasy载体为Promega公司产品。限制性内切酶为BioLab公司产品。引物合成和DNA测序由上海生物工程技术有限公司完成。其他常规试剂为国产分析纯。1.2方法1.2.1胸腺组织总RNA的抽提和反转录反应颈椎脱臼法除死小鼠后，750ml/L乙醇浸
7、泡小鼠5min,取出胸腺后，先用眼科剪剪碎，然后用匀浆器研磨均匀，抽提RNA（按试剂盒中的说明书进行操作），用紫外分光光度法鉴定其纯度,甲醛变性凝聚胶电泳鉴定其完整性。经电泳证实RNA无降解后进行反转录，操作按QiaGen的反转录试剂盒说明进行。1.2.2引物设计和PCR扩增：根据GenBank中鼠CDld2基因的序列（登录号为：NM007640）,设计两条引物，引物1：5'-ATGGGGTACCTACCGTGCCTG-3’；引物2：5'-TCACCGGATGTCTTGATAAGCGCT-37,用以扩增mCDld2oPCR条件为：94°C变性
8、30s、55°C退火60s、72°C延伸1min,32个循环后，于72C延伸7min。琼脂糖凝胶电泳分析后,回收纯化PCR产物。1.2.3cDNA克隆与鉴定：将纯化
