超深度测序技术在HBV准种研究中的应用进展.pdf

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1、中华肝脏病杂志2014年5月第22卷第5期ChinJHepatol，May2014，Vo1．22，No．5·389·超深度测序技术在HBV准种研究中的应用进展【关键词1肝炎病毒，乙型；准种；超深度测序Sanger-毛细电泳测序。该方法操作较为省时省力，但是只能IdentificationofhepatitisBvirusquasispeciesbyultra-deep检测病毒种群中>2o％1的变异，敏感性较低，难以检测病毒sequencingWangMing]ie,GongLing,ZhangXinxin．准种中相对比例较低的变异株。反向杂交技术中常用的反[KeywordslHepa

2、titisBvirus；Quasispecies；Ultra—deep向线性探针杂交技术(1ineprobeassay，LIPA)，能够检测sequencing到在病毒种群中>5％的变异，其敏感度相比直接测序有所【Firstauthor’Saddress]DepartmentofInfectiousD~eases，提高嘲。由Innogenetics公司开发的INNO-LAHBVDRRuijinHospital，SchoolofMedicine，ShanghaiJiaotongv2试剂盒已经能够用于临床检测，对于常见核苷(酸)类University,Shanghai200025,Chi

3、na似物[nucleos(t)ide，Nas]，如拉米夫定(LAM)、替比夫定、Correspondingauthor：ZhangXinxi~Email：zhangxinxin@咖．阿德福韦酯和恩曲他滨的耐药突变均可进行检测，但由于价CD．C格昂贵等因素未在国内普及吲。赖国旗等基于反向探针杂交技术构建了一种检测拉米夫定耐药突变的方法，并通过与准种(quasispecies)这一概念最早由Eigen⋯在研究直接测序比较，认为其准确度、敏感性等方面都优于直接测RNA分子复制机制时提出。目前，病毒学家公认的准种概序法，符合了临床检测的要求。LIPA只能对少数已知的突变念是指：受到遗传变异、

4、竞争和选择等一系列过程影响的高位点进行检测，无法对整个病毒准种中的变异进行完整的分度相关的但不完全相同的变异株和重组基因组组成的动态种析，而且有较高的假阳性及假阴性率。除外上述的研究方群。1993年，Blum首先提出乙型肝炎病毒(HBV)存在法，PCR一克隆一测序法为HBV准种研究的“金标准”，在准种的假说。HBV复制过程中的高复制率和高出错率，导国内外很多病毒准种研究中使用了这种方法“。克隆一测序致大量变异株的产生，这些变异株组成了HBV准种。进一技术对检测病毒种群中相对比率较低的变异株有较高敏感性，步的研究发现，HBV准种可能与患者的临床表现、抗病毒治但花费较多，且费时费力J。此

5、外，在克隆挑取的过程中存疗结果以及乙型肝炎疫苗的作用效果等密切相关。随着科学在随机性，一个患者样本能够提供克隆测序的数目似乎不能技术的发展，各种新技术逐渐被应用于HBV准种研究。近充分代表整个病毒种群的遗传变异，所挑取的克隆与患者血年来，DNA测序技术被不断改进和创新，第二代测序技术清中的准种组成相比存在偏倚。随着测序技术的发展及以其超深度和高灵敏度等特点给HBV准种带来了新的研究第二代测序技术平台的商品化，超深度测序这种全新的技术策略。现就HBV准种的研究技术(特别是第二代测序技术)逐渐在HBV准种的研究中得到应用。以及应用该技术所取得的研究进展做一综述。二、超深度测序与病毒准种研

6、究一第二代测序技术未出现之前，传统的sanger测序在、HBV准种研究技术概况在目前关于HBV准种的研究工作中，常见方法有PCRDNA测序中占据了压倒性的比例优势，在过去的数十年里极直接测序、PCR-克隆一测序、反向杂交等，还有新出现的超大地推动了生命科学的进步。但Sanger测序的局限陛在于深度测序技术(ultra—deepsequencing，UDS)。它对于电泳分离技术的依赖，以及无法再进一步地扩大并行不同的研究技术在病毒准种研究中有各自的优缺点和适和微量化，造成克隆一测序技术对病毒准种进行序列测定的用性。直接测序法，即PCR测序法，其测序方法为传统的规模限制和花费较高“。第二

7、代测序技术使用通用接头进行高通量的并行PCR和并行测序反应，并结合微流体技术，利DoI：10．3760／cma．j．issn．1007—3418．2014．05．015用高性能的计算机对大规模的测序数据进行拼接和分析，实基金项目：国家自然科学基金(81171616)，上海市科委政府现了测序的高通量化“。目前，商品化的第二代测序技术平间国际科技合作项目(11410701700)台主要有罗氏／454公司的GSFLX测序平台、IUumina公作者单位：20002