高通量测序技术及其在植物研究中的应用

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1、2012年第4期辽宁林业科技2012JournalofLiaoningForestryScience&TechnologyN24高通量测序技术及其在植物研究中的应用冯健'赵雪歲2(I•辽宁省林业科学硏究院辽宁沈阳H00322.辽宁省林业调查规划院辽宁沈阳110122)摘要：隨着"后基因组时代"的到来，国际学术界已经认识到发展快速低成本测序技术的重要性。在这样的背景下•高通量测序技术应运而生具代表性技术平台有Roche的454测序技术、Illumina的Solcxa测序技术和ABI的Solid测序技术。笔者通过查阅相尖文献系统回顾了第1代测序技术发展过程详细叙述了高通量测序技术原理和方法•探讨

2、了高通量测序技术在植物分子生物学研究中的应用。尖键词高通量测序技术淤J序技术；植物中图分类号Q503文献标识码：A文章编号1001-1714001304-0029-07收稿日期2012-02-22基金项目：引进国际先进林业科学技术项目(2012-4-39)辽宁省科学技术计划重大项目(2011207002)；林业转基因生物安全性监测项目(JJ-11-03)。2003年4月14H，美国人类基因组研究项目首席科学家CollinsF博士在华盛顿隆重宣布:人类县因组序列图绘制成功，人类基因组计划(HumaiGenomeProject,HGP)的所有目标全部实现。这标;〃人类基因组计划"胜利完成和"后基

3、因组时代"(PostGenomeEra’PGE)正式来临山。进入后基因组时代功能基因组学、系统基因组学等研究越来越受到重视与之相应的是对测序技术的需求有增无减，传统的测序方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求。国际学术界已经清醒地认识到发展快速低成本测序技术的重要性。2006年10月美国加州SantaMonica的XPrize基金会承诺给第1个实现1000美元人类全基因组测序的个人或单位颁发1000万美元的奖金,成为有史以来生物医学领域奖金额度最高的科技奖足见人类科学对测序技术的需求。正是在这样的背景下，高通量测序技术应运而生其代表性技术平台有Roche的454测序技术.

4、Illumina的Solexa测序技术和ABI的Solid测序技术。这些技术的共同特点是高通量和低成本。1第1代DNA测序技术自20世纪70年代中期问世以来,DNA测序技术迅速发展，极大地推动了生物学的发展，成为分子生物学硏究中最常用的技术。每经过几年，测序速度就呈指数增长与半导体工业发展的摩尔定律(Moore'sLaw)非常相似汽这种高速的发展腿动了基因组学及其分支乃至其他密切相关学科怎创立与发展，诸如比较基因组学、生物信息学、系纭生物学以及合成生物学。经过几十年的发展,DN?测序技术大致可分为3个时期，第I时期，1977年MaxamGilbert报道了通过化学降解测定DNAJ?列的方法。

5、同一时期ganger发明了双脱氧链终JLt法。20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术桧DNA测序带入自动化测序的时代冋。第2时期为最近几年发展起来的高通量测序技术，如Roche的454测序技术、Illumina的Solexa测序技术、ABI白fSolid测序技术、PolonatorG.007。CompleteGenomics公司最近推出基于其专利技术的测序朋务平台，但该公司并没有表示要在市场销售这一设备。目前基于单分子读取技术的第3代测序技苏也已出现。1977年，英国剑桥的FredSanger和美国哈佛出AlanMaxam和WalterGilbert领导的2个研究小绽几乎同时发明了DNA序

6、列测定方法，这为发展快速高效的DNA测序方法带来了曙光。Sanger的牙法是用酶法降解DNA，而Maxam-Gilbert采用的是化学断裂法。这两种DNA降解的方法中，前者旻简便、更适合于光学自动探测，因此大多数的DNA自动测序仪都采用这种方法将DNA链进行降解。Sangei•的酶法又称二脱氧链末端终止法，原理是:核酸模板在DNA聚合酶、引物、4种单脱氧核苜三磷酸(dNTP其中的一种用放射性P32标记)存在条件下复制时,在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苜三磷酸(ddNTP)，因为双脱氧核苜没有3^-OH戶斤以只要双脱氧核苗掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苜，链就可以

7、继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为丁端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后分4个泳道进行凝胶电泳分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后根据片段丁端的双脱氧核苜便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序心)。基于Sanger原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，就形成了荧光自动测序技术。1985年,Smith等采用激光激发标记的荧光，并用CCD检测，比