长白山区杓兰属植物ISSR-PCR最佳反应体系的建立-论文.pdf

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1、·生物技术·北方园艺2013(24)：92～95长白山区杓兰属植物系的建立孙叶迎，陈丽飞，刘树英，刘昕，曹岩，刘洪章(吉林农业大学生命科学学院，吉林长春130118)摘要：以长白山区的5种杓兰属植物大花杓兰、杓兰、东北杓兰、山西杓兰、斑花杓兰为试材，对影响PCR扩增效果的模板浓度、引物浓度、dNTP浓度、Taq酶量以及退火温度进行了优化，以期建立杓兰属植物ISSR-PC,R的反应体系。结果表明：25L反应体系中DNA模板的量为30．()(]ng、引物0．60／~mol／L、dNTP0．2Ommol／L、Taq酶0．75U；该体系以5种杓兰属植

2、物，4个引物进行扩增验证，能够得到清晰的条带，且具有多态性，而且有可重复性；表明建立的杓兰属ISSR_PCR体系适用遗传多样性的研究。关键词：长白山区；杓兰属；ISSR；反应体系中图分类号：S682．31文献标识码：A文章编号：1001-0009(2013)24一。O92—04杓兰属(CypripediumLinn．)为兰科多年生草本植术研究杓兰属植物的遗传多样性、种质资源研究、分子物⋯。由于花唇瓣特化呈兜状，被称为“大口袋花”．西方育种等提供依据。人称其拖鞋兰。杓兰属植物花形奇特、颜色艳丽，具有1材料与方法极高的观赏价值。杓兰属共有5O余种

3、，主要产于东亚、1．1试验材料北美、欧洲等温带地区和亚热带山地，向南可达喜马拉供试大花杓兰、杓兰、东北杓兰、山西杓兰、斑花杓雅地区和中美洲的危地马拉[。我国杓兰属植物种类兰5种杓兰属植物材料均采自吉林省长白山区。取材繁多，资源丰富，有30余种，广布于东北至西南山地和台料的嫩叶用锡箔纸包好放入到液氮中，置于一8O℃超低湾地区高山[2]。在长白山区分布的杓兰属植物有大花温冰箱中备用。杓兰、斑花杓兰、杓兰、东北杓兰和山西杓兰。针对杓兰Taq酶(5U／I)、dN'I、Ps(25retool／I)、2000bp属遗传学和分子生物学方面的研究较少，目前在

4、遗传标DNAMarker均购于大连宝生物工程有限公司，引物由记方而的研究以AFI、RAPD法为主，对其遗传结构以北京三博远志生物技术有限责任公司合成。CTAB、及多样性进行分析。。I。ISSR(Inter—SimpleSequencePVP、l3一巯基乙醇、琼脂糖等为北京鼎国生物技术有限公Repeat，ISSR)简单重复区问序列标记，是由加拿大蒙特司生产的分析纯试剂。利尔大学的Zietkiewicz等于1994年提出的一种建立1．2试验方法在PCR技术上的分子标记技术。该技术具有操作简单、1．2．1DNA的提取以及检测采用改良的C1法成本低、

5、条件稳定、快速、灵敏、检测多态能力强、所需提取DNA。用l的琼脂糖凝胶(含核酸染料)电泳检DNA模板量少等优点，目前已被广泛应用于植物品种测DNA质量，同时取1肚L样品用紫外分光光度讣测定鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子生DNA的浓度以及纯度。将样品稀释为20ng，／t,I并存放态学等研究。。。。于-20℃冰箱中备用，以便用于ISSR反应条件的优化。该研究对杓兰属植物IS~SR反应体系进行优化，并1．2．2杓兰属ISSR反应体系的优化试验以UBC847对PCR反应程序中的退火温度进行优化，以期建立适合引物对影响杓兰属植物的IS

6、SR反应的主要因素Taq酶杓兰属植物的ISSR-PCR反应体系，为利用ISSR标记技浓度、dNTPs浓度、DNA模板量、引物浓度优化。每组试验中除r试验的成分以外，其它成分与其它组试验成第一作者简介：孙叶迎(1989)，女，硕士研究生，研究方向为分子分相同。参考文献Ell—l4]，采用25L体系，在基本反标记。E-mail：sunyeying3928@163．com．应体系中所含的成分有：2．5肚I10×buffer，责任作者：刘洪章(1957一)，男，博士，教授，博士生导师，研究方向0．15mmol／IdNTP，0．40gmol／L引物，3

7、O．O0ngDNA为植物资源。E-mail：1hz999@126．COIII．基金项目：农业部野生植物资源调查资助项目；吉林省科技厅资模板，最后加双蒸水补足。助项目(20100254)。1．2．3退火温度的选择在单因素筛选出最佳反应体收稿日期：2O13一O9—13系后，没置退火温度为47℃、5O℃、53℃、56℃、59℃进行92北方园艺2o13(24)：92～95·生物技术·系中dNTP能与Md结合，使游离的md。。浓度降低。[5]ZietkiewiczE，RahhA，ImbudaD．Genomefingerprintingbysimples

8、e—quencerepeat(SSR)一anchoredpoly—merasechainreactionamplification[J]．因此，dNTP的浓度直接影