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《鼠抗人纤维蛋白单链抗体-尿激酶杂合基因的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、生物技术通讯LETTERSINBIOTECHNOLOGYVol.10No.2Jun.1999·109·鼠抗人纤维蛋白单链抗体-尿激酶杂合基因的构建*及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达1111舒东俞炜源赵志玲徐兵罗深秋(军事医学科学院生物工程研究所北京100071)摘要采用DNA重组技术构建了表达鼠抗人纤维蛋白单链抗体与低分子量尿激酶融合基因的真核表达载体。通过磷酸钙共沉淀法,将该表达载体转染到中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺-陷株(CHO-dhfr)中,利用选择培养基筛选出稳定表达的细胞株,溶解圈法测定融合蛋白的表达水6平为每10细胞每天58IU。该融合蛋白保留了与纤维蛋白
2、的结合活性和溶解纤维蛋白的溶纤活3性。SDS-PAGE,Western印迹法分析证明融合蛋白的相对分子质量约为70×10。-关键词单链抗体;低分子量尿激酶;融合蛋白;CHO-dhfr细胞Theconstructionofmouseagainsthumancross-linkedfibrinScFv-urokinasehybridgeneanditsexpressioninChinesehamsterovarycellShuDong,YuWeiyuan,ZhaoZhiling,XuBing,LuoShenqiu(InstituteofBiotechnology,Beijing
3、100071)AbstractTheeukaryoticexpressionvectorcontainingmouseagainsthumancross-linkedfibrinScFv-urokinasefusiongenehadbeenconstructedbyaseriesofDNAmanipulationandwastrans--fectedintoCHO-dhfrcellsbycalciumphosphateprecipitationtechnique.Afterselectionandsubcloning,afewnewcellstrainsthatcanexp
4、ressthefusionproteinwereobtained.Theexpres-6sionlevelofthefusionproteinreached58IU/10cells/dbyFAPA(fibrinagaroseplateassay).Theexpressedfusionproteinremainedthecapacitytoactivateplasminogenandbindfibrin.SDS-PAGEandWesternblotanalysisshowedthatthemolecularweightofthefusionproteinwasabout70k
5、D.-KeywordsScFv;Scu-PA-32K;fusionprotein;CHO-dhfr尿激酶原(pro-UK)亦称单链尿激酶,它是一种胞克隆,这为今后研究双功能融合蛋白的体内外特3由411个氨基酸残基组成的相对分子量为54×10异溶栓活性并评价其作为新型导向溶栓制剂的前景的糖蛋白,经纤溶酶(plasmin)作用变成尿激酶。该奠定了良好的基础。酶具有选择性溶栓作用,临床应用不易引起全身性[1～5]出血,是第二代新型溶栓制剂。为了提高尿激酶1材料与方法在体内的定向溶栓作用,我们将抗纤维蛋白单链抗体基因与低分子量尿激酶基因融合后,插入到真核1.1菌种和质粒表达载体中,
6、然后转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸大肠杆菌DH5α,质粒pUCALL32K,真核表达-还原酶基因缺陷株(CHO-dhfr),经过一系列的筛选后,获得了既有溶解纤维蛋白活性又有与D-二聚*国家科技部863计划资助课题体(D-dimer,DD)结合能力的双功能融合蛋白的细1第一军医大学生物技术通讯·110·LETTERSINBIOTECHNOLOGYVol.10No.2Jun.1999载体pcDNA3,克隆载体pUC19均由本室保存。纤维蛋白溶解平板法(FAPA)的测定,按文献1.2细胞和培养基[8]的方法进行。细胞生长培养基是DMEM中含10%小牛血1.8融合蛋白的分离纯化清,
7、青霉素和链霉素各为100U/ml,卡那霉素50用抗pro-UK抗体IgG偶联到溴化氰活化的U/ml,L-脯氨酸0.1mmol/L,L-甘氨酸0.1mmol/Sephrose-4B上,制成亲和色谱柱。采用亲和色谱法L,谷氨酰胺2mmol/L,次黄嘌呤0.03mmol/L,胸纯化融合蛋白。腺嘧啶0.03mmol/L,用NaHCO3调pH值为7.01.9SDS-PAGE和Western印迹分析～7.4。选择培养基是生长培养基加400μg/ml参照文献[9]进行。用亲和色谱法纯化的融合蛋G418,无血清选择培养基为选择培养
