植物酯酶提取工艺.doc

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1、植物酯酶提取工艺：（1）酶活测定条件的优化，如pH值，时间，底物浓度，显色剂用量及浓度等。（2）植物酯酶或胆碱酯酶的溶剂提取条件的确定如：溶液的种类、固液比、温度、时间等。（3）纯化条件如超滤、凝胶、离子交换等条件的确定。（4）经纯化后的纯酶的酶学性质如：热稳定性、pH稳定性、金属对酶活性的影响。1、标准曲线的绘制称取0.0036gα-萘酚（分子量：144.17），溶解于无水乙醇中，定容至100mL，得0.25mmol/L溶液。分别移取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mLα-萘酚溶液，用磷酸缓冲液稀释至10mL。在各比色

2、管中分别加入0.5mL0.08%固兰B盐3.6%SDS显色剂，置于30℃恒温水浴5min后做光谱扫描，并在最高吸收峰测吸光度。用测得的结果做标准曲线。1）PH的影响磷酸缓冲液：6、6.5、7、7.5、8比较：以缓冲液为空白作基线，固兰B盐+缓冲液扫描，求出A0，比较大小。不同PH条件下，各最大吸收波长偏移情况，及A值大小。不同pH条件下，其标准曲线线性2）固兰B盐的浓度影响1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.08%、0.02%等，求出A0，以缓冲液为空白作基线不同浓度下，做标准曲线将固兰B盐放置，每天测A。，估计能放置保存天数。3

3、）加入SDS浓度0、0.1、0.2、0.5、1、2、3、3.6空白，A0取一中间浓度的扫描求最大吸收波长，及A于冰箱及常温下放置，求A、A0确定最佳浓度及固兰B盐能放置的时间。取0.5mL稀释酶液，加入4.5mL缓冲液（可定容至5mL），加入0.5mLα-乙酸萘酯溶液，30度，反应5min，缓冲液定容至10mL，加入0.5mL固兰B盐，置于30℃恒温水浴5min1)乙酸萘酯乙醇溶液浓度影响0.04、0.02、0.015、0.0005等测（萘酯+显色剂）A0，及A，最大吸收波长2）加入乙酸萘酯溶液体积的影响4）最后恒温水浴时间、温度的选

4、择5）初始缓冲液pH选择6）酶液的稀释倍数于固液比（1：7）水,于35度，150rpm,振荡30min提取，4度，1）固液比2）温度选择3）反应时间4）提取液的种类（水、不同pH）5）转速