嗜热菌Thermus thermophilus HB8铁硫簇合成途径中IscA和IscU蛋白的表达、纯化和功能研究.pdf

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1、首都师范大学学报(自然科学版)第35卷第2期JournalofCapitalNormalUniversityNO．22014年4月(NaturalScienceEdition)Apr．，2014嗜热菌ThermusthermophilusHB8铁硫簇合成途径中IscA和IscU蛋白的表达、纯化和功能研究吴琦谭菲刘晓晴(首都师范大学生命科学学院，北京100048)摘要Fe—S簇可参与电子传递和基因调节等过程．实验以嗜热菌ThermusthermophilusHB8基因组为模板，通过PCR扩增获得Fe．s簇ISC系统生物合成途径中的IscA和IscU基因，并克隆连接到表达载体pET一28a(+)上

2、．重组质粒转化E．coliRosetta(DE3)进行表达。用亲和层析纯化得到浓度和纯度都较高的IscA和IscU蛋白．SDS．PAGE分析，证实其分子量大小分别为13．7KD和14．8KD．实验确定IscA是单聚体，IscA上能形成铁硫簇，IscU上不能形成铁硫簇．在厌氧条件下，RNA的量能提高1．5倍，但是IscA和IscU的表达量都会降低，说明厌氧对这两个基因有损伤．关键词：嗜热菌ThermusthermophilusHB8，克隆，体外重组．中图分类号：Q78铁硫簇是自然界中最普遍存在的一种还原结构白质间多数是依靠半胱氨酸连接菱形的氨酸残基连的中心．它们主要参与底物的结合与活化、电子传接

3、，也有的是通过非半胱氨酸作用到铁硫簇结构上，递、铁离子／硫离子的存贮、基因表达的调节、酶活、如组[2Fe一2S]或者立方形的[3Fe-4S]，以及氧原子DNA修复和感受环境变化等各方面⋯．铁硫簇与蛋连接到立方烷形的[4Fe4S]．c／ccys一F。＼c《scysvs—F誉(b)【2Fe·2Sl簇(c)[4Fe-4SI簇(d)【7Fe·9S-Mo]簇图I铁硫簇的结构示意图铁硫簇的形成不是自发的，需要复杂的机制来铁硫蛋白的合成至关重要，因为E．coli中的这段基安排它们的组装，并且在之后转运到单体蛋白因的突变会导致细胞铁硫蛋白活性的下降．ISC系上．对于细菌的Fe．s结构的生物合成方式，已经统中I

4、scS、IscU和IscA是铁硫簇组装的核心蛋白，确定了三种系统，包括ISC(铁硫簇结构)、NIF(固他们对于铁硫簇的组装非常重要．HscB和HscA是氮)及SUF(硫)．在细菌中这三个系统分别有三个一对分子伴侣蛋白，Fdx是一种含[2Fe一2S]簇的铁操纵子编码：nif(”iscA．nifSV)、isc(iscSUA．hscBA．氧还蛋白，Fdx在铁硫簇的组装过程中起着电子供)和suf(sufABCDSE)．在这三个系统中，ISC系统体的作用．ISC系统利用铁和硫合成铁硫簇的前驱对于Fe—s的生物合成有着更普遍的意义，iscSUA．体，然后将其运送到合适的目标蛋白．而NIF只是存hscBA-

5、fdx是一段高度保守的基因序列，对于细菌中在于使固氮酶成熟的系统中，SUF系统只是Fe．s合成的一个小分支．ISC系统在许多生物的基因组序收稿日期：2013-04-07列中都存在，从细菌和古生菌到植物和人，因此ISC·通讯作者是生物合成Fe—s结构的基本途径．49首都师范大学学报(自然科学版)E．coli中首先发现的是ISC和SUF两种系统，解出晶体结构，是五聚体，功能还不确定．SUF系统最开始在大肠杆菌中被发现，和ISC系统本研究选用嗜热菌ThermusthermophilusHB8不同的是，Suf基因可以在应激条件，如缺铁和氧化株为研究材料，克隆表达出IscA和IscU蛋白，为下应激条件下

6、表达．最近，在大肠杆菌中又发现了第三一步进行功能研究，奠定基础．个系统，即CSD系统(半胱氨酸亚磺酸脱亚磺酸1材料和方法酶)，但其对铁硫簇生物合成的重要生理条件还不清楚，E．coli中的NifS同系物，IscS，CSD和SufS／1．1材料CsdB都能够催化L一半胱氨酸上的脱硫和L．硒代半1．1．1菌株和质粒胱氨酸上的脱硒．极端嗜热栖热菌(ThermusthermophilusHB8)为嗜热菌ThermusthermophilusHB8有SUF和实验室保存；表达菌E．coliBL21(DE3)、BMRosettaISC两个系统．SUF系统分为SufSE和SufBCD两个(DE3)购白博迈德公司

7、；表达载体pET-28a(+)为复合体及一个蛋白SufA，Isc系统的组成尚不明确．本实验室保存．目前关于IscA的功能尚存在争议：一种观点认1．1．2工具酶与试剂为IscA的作用是为铁硫簇的组装提供铁离子，来限制性内切酶、DNAT4连接酶购自Fermentas源于Saccharomycescerevisiae的IscA菌株中IscA的公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自OMEGA缺失会引起线粒