资源描述：
《嗜热菌Lon蛋白酶的功能分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、首都师范大学学报(自然科学版)第30卷第5期JournalofCapitalNormalUniversityNo.52009年10月(NaturalScienceEdition)Oct.,2009嗜热菌Lon蛋白酶的功能分析王昕刘晓晴(首都师范大学生命科学学院,北京100048)摘要Lon蛋白酶是一种在各种生物体内广泛分布并且具有多种生物功能的蛋白质.以嗜热栖热菌(ThermusthermophilusHB8)的Lon蛋白酶(TTLon)为研究对象,将TTLon蛋白酶的编码基因克隆至pTrcHis载体,并在大肠杆菌中进行了成功表达,采用Ni2NTA亲和
2、层析对其进行分离纯化,并通过一系列实验证明Lon蛋白酶能够与ATP结合,具有依赖ATP的蛋白酶活性和依赖ATP的分子伴侣活性.关键词:Lon蛋白酶,ATP依赖型蛋白酶,分子伴侣.+中图分类号:Q55613Lon蛋白酶广泛地分布于微生物、动植物和人何识别底物的,哪些功能的发挥是依赖ATP的?[1-5]类中,是一种多结构域的、ATP依赖型的蛋白本研究将嗜热菌Lon蛋白酶在大肠杆菌中成功酶,它降解细胞内特殊的调节蛋白质、有缺陷的蛋白进行了表达,并对TTLon的各种功能进行了初步研[6]质和异常蛋白质.在细菌中Lon蛋白酶在DNA损究,为进一步认识TTLon在
3、生物体内的作用机理奠伤修复,逆境应答和细胞密度感受等生物过程中起定了一定基础.我们选用嗜热菌Lon蛋白酶为研究着不可替代的作用,真核生物Lon蛋白酶还参与线对象,是由于热稳定性蛋白质比较适合于X射线晶粒体维护及呼吸作用,哺乳动物线粒体Lon蛋白酶体学分析和核磁共振(NMR),有利于我们进一步对因在去除氧化性损伤蛋白的过程中起到重要作用,其进行结构分析.所以被揭示与线粒体功能随年龄增长而衰减的过程[6]1材料与方法密切相关“.通过大量的研究表明Lon蛋白酶介[7][8]导异常蛋白质和短寿命蛋白质的周转,同时还111材料在蛋白质酶解过程中严格识别底物并且帮
4、助决定胞11111菌种和质粒内蛋白质的寿命.另外Lon蛋白酶通过降解特定的嗜热栖热菌(ThermusthermophilusHB8),大肠杆蛋白质来参与到诸多生物功能的实现过程中去,比菌E.coliDH5α,大肠杆菌E.coliBL21为本实验室[9]如细胞分裂,荚膜寡糖的合成等.此外Lon蛋白酶保存;克隆载体(pGEM2Tvector)试剂盒购自Promega还能与DNA结合,并影响DNA的复制和基因的表公司;表达载体pTrcHisA购自Invitrogen公司.[10]达.Lon蛋白酶执行着如此众多的生物功能并且11112主要试剂广泛地存在于各种生
5、物体内,由此可见Lon蛋白酶质粒提取试剂盒购自Omega公司;限制性内切在生物体内占有非常重要的地位,到目前为止虽然酶BglⅡ、EcoRI,LATaq酶和T4DNA连接酶均购于已经对Lon蛋白酶进行了多方面的研究,但对Lon宝生物(大连)工程有限公司;DNAMarker,Protein蛋白酶的作用机理还了解很少,如Lon蛋白酶是如Marker和DNA胶回收试剂盒均购自天根生化(北京)科技有限公司.亲和层析填料Ni2NTASuperflow和层析柱购自Qiagen公司;氯化钙、偶氮酪蛋白收稿日期:2008212216(azocasein)购自Sigma公
6、司;Suc2Leu2Leu2Val2Tyr23国家自然科学基金资助(Nr.30870053)33通讯作者.E2mail:liuxq@mail.cnu.edu.cnAMC,为德国Tuebingen大学生化所Bisswanger教授35首都师范大学学报(自然科学版)2009年的赠品.其他生化试剂均为国产或进口分析纯试剂.11214目的蛋白表达和纯化11113培养基和抗生素将双酶切验证正确的转化菌接种至含氨苄青霉LB液体培养基(1%NaCl,1%tryptone,015%素(终浓度为100μgPmL)的LB培养液中,37℃振荡yeastextract),LB
7、固体培养基含有115%的琼脂.氨(150rPmin)培养过夜,再以2%～5%的量转接到200苄青霉素贮液浓度为100mgPmL.mL新鲜LB培养液中,继续培养至OD600为014～016112方法时,加入异丙基2β2D2硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度11211T.thermophilusHB8基因组DNA的提取1mmolPL,在30℃诱导培养4h后,离心收集菌体.将T.thermophilusHB8接种于LB培养液中,水每克菌体(湿重)加入2～5mL裂解液(50mmolPL浴摇床70℃振荡培养(190rPmin)过夜.当细菌培养NaH2PO4,300
8、mmolPLNaCl,10mmolPL咪唑,pH810)物达到饱和状态,利用CTAB法提取基因
