葡萄β型液泡加工酶基因（VvβVPE）的原核表达、纯化与多克隆抗体制备.pdf

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1、糍赣熊精璇嘏磴藏农r0nnali1neosfysAte妻gmr：http：／／www．jabiotech．orggy帕■I_曼研究报告Letter葡萄I3型液泡加工酶基因(VvfiVPE)的原核表达、纯化与多克隆抗体制备巩培杰。'张朝红，魏蓉'。李树秀，王跃进1,2,31西北农林科技大学园艺学院，杨凌712100；2农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，杨凌712100；3旱区作物逆境生物学国家重点实验室(西北农林科技大学)，杨凌712100通讯作者，zhangchaohong@nwsuaf．edu．cn摘要液泡加工酶(VPE)基因是植物内启动

2、和执行细胞程序性死亡的关键基因，I3型是种子特异表达并且为种子蛋白成熟所必须的基因。本研究以黑比诺葡萄(VitisviniferaCV．PinotNoir)花后8个不同时期胚珠的cDNA混合样为模板，通过RT-PCR扩增得到葡萄B型液泡加工酶基因(暂命名VvfiVPE，GenBank登录号：KC136352)，开放阅读框1485bp。进一步将VvfiVPE克隆到pGEX．6P一1原核表达载体并转入大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21中，经IPTG诱导，获得约81_3kD的包涵体融合蛋白GST—Vv[3VPE。将诱导条件优化后，在37~C、0．

3、05mmol／LIPTG诱导5h后融合蛋白GST-Vv[~VPE的表达量最大，采用电透析与盐酸胍处理后透析复性两种方法获得纯化包涵体蛋白，电透析纯化法获得纯化包涵体蛋白的浓度可达到免疫要求。使用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗血清，经Westernblot检测，该抗血清(稀释到1：10ooo)与GST-Vv[3VPE融合蛋白识别反应良好，获得的抗血清可用于以后的VvI3VPE的酶活性分析、免疫亚细胞定位分析以及转基因植株蛋白水平的鉴定等，为进一步明确VvpVPE在葡萄胚珠发育中的作用提供基础数据。关键词葡萄，液泡加工酶，原核表达，多克隆抗体Fusion

4、ExpressionandPurificationofI3TypeVacuoleProcessingEnzymeGene(VvflVPE)inVitisviniferaandItsAntibodyPreparationGONGPei-Jie，’。ZHANGChao-Hong，。，。WEIRong''LIShu—Xiu''WANGYue．Jin，'。1CollegeofHorticulture，NorthwestAgriculturalandForestryUniversity,Yangling712100，China；2KeyLaboratoryofBio

5、logyandGeneticImprovementofHorticulturalCrops(NorthwestRegion)，MinistryofAgriculture，China，Yangling712100，China；3KeyLaboratoryofCropStressBiologyinAridAreas(NorthwestAgriculturalandForestryUniversity)，Yangling712100，ChinaCorrespondingauthor,zhangchaohong@nwsuaf．edu．cnAbstractVacuo

6、leprocessingenzyme(VPE)genefamilyplaysanimportantroleinmediatingandexecutingprogrammedcelldeathinplants．ptypeVPEisspecificallyexpressedinseed，whichisindispensableinseeddevelopment．TheovuleswereharvestedfromviniferaCV．PinotNoirin8differentdevelopmentstages．RNAwasisolatedfromtheseov

7、ules．VvflVPEgenewasobtainedbyRT-PCR，andthemixtureofcDNAwasusedastemplate．TheresultsshowedVvflVPEgenecontainedacompleteORF(openreadingframe)sequence(1485bp)encoding494aminoacid(GenBankaccessionnumber：KC136352)．Theful1．1engthsequencewas基金项目：国家自然科学基金项目(No．31171926)、公益性行业(农业)科研专项经费(No

8、．2o0903044)和中央高校基本科研业务费(No．QN2009