维拉帕米对甲状腺未分化癌耐药株阿霉素敏感性作用的研究.pdf

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1、研究专辑2014年第18卷第2期实用临床医药杂志JournalofClinicalMedicineinPractice·5·维拉帕米对甲状腺未分化癌耐药株阿霉素敏感性作用的研究郑帅，许馨予，崔岱，杨涛，郑旭琴(南京医科大学第一附属医院内分泌科，江苏南京，210029)摘要：目的研究维拉帕米对甲状腺未分化癌耐药细胞株阿霉素敏感性的影响及其作用机制。方法用阿霉素诱导甲状腺未分化癌细胞株HTh74建立耐药细胞株HTh74R，RT—PCR检测HTh74和HTh74R细胞中耐药相关基因ABCG2、MDR1及MRP1的表达情况，四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(

2、MTY)检测阿霉素对HTh74、HTh74R、HTh74R联合维拉帕米组3组细胞增殖的影响，通过测定Caspase-3活性，探究维拉帕米的作用机制。结果HTh74R和HTh74细胞的形态及生长曲线无差异，但前者较后者具有显著增强的耐药性，且高表达ABCG2和MDR1基因，二者MRP1基因的表达无统计学差异；HTh74R细胞中，阿霉素联合维拉帕米组较阿霉素单药组半数抑制浓度(IC50)明显下降，且Caspase．3活性明显升高。结论ABC转运体阻滞剂维拉帕米通过提高Caspaae-3的活性促进凋亡，增强HTh74R对阿霉素的敏感性，可能为解决甲状腺未

3、分化癌临床药物治疗的耐药问题提供新的解决路径。关键词：甲状腺未分化癌；阿霉素；维拉帕米；ABC转运家族；Caspase．3中图分类号：Q2-33文献标识码：A文章编号：1672-2353(2014)S2-005-04甲状腺未分化癌恶性程度大，预后差。联合oC、5％CO培养箱中培养。化疗、手术、放疗的综合治疗取得了一定的疗1．2．2耐药细胞的培养使用阿霉素诱导HTh74效⋯，其中阿霉素是化疗中最常选用的药物。肿细胞耐药，浓度自0．01~g／mL逐渐增至0．50瘤单纯使用化疗药物治疗效果不佳，与肿瘤本身mL，培养6个月，建立HTh74耐药细胞(HTh7

4、4R)。表达的耐药基因及药物诱导的耐药基因表达增多1．2．3体外增殖试验收集对数期甲状腺肿瘤密切相关。研究表明ATP结合盒式蛋白细胞，每孔加入200L细胞悬液，以5×10爪／(ABC)转运家族在肿瘤耐药中发挥重要作用J。孔的密度接种于96孔板。37℃、5％CO孵育24本研究以阿霉素诱导甲状腺未分化癌细胞株耐h后，予无血清培养液单独培养或加人不同浓度药，检测ABC转运家族中MDR1、ABCG2、MRP1阿霉素或阿霉素联合维拉帕米继续培养24h或的表达情况。使用ABC转运体阻滞剂维拉帕米，48h。每孔加人20LMTT溶液5mg／mL，继续观察其对耐药株

5、阿霉素敏感性的影响，并探索作培养4h。弃上清，每孔加入150ILLDMSO，置于用机制，为临床治疗寻求新的路径。摇床上低速振荡10min。应用酶联免疫检测仪，光密度(OD)492nm处测量各孔吸光度值。每组1材料与方法设6个复孔，重复3次。1．1材料1．2．4实时荧光定量(RT．PCR)提取HTh74人甲状腺未分化癌细胞株HTh74(德国柏林及HTh74R细胞的RNA，使用TaKaRaPrime—洪堡大学夏洛特医学院赠)，Ham’sF12培养基ScriptTMRTreagentKit将RNA逆转录成cDNA。(购自北京清大天一科技有限公司)、胎牛血

6、清RT—PCR反应条件：预变性94℃5min，变性94(购自美国Gibco公司)，阿霉素、维拉帕米(购自℃30S，退火30s，延伸72℃30s，共25—30个美国Sigma公司)。循环，最后72℃延伸10min。各引物序列如下：1．2方法B—actin(280bp)上游5’．CCCAGGACCAGGGCGT．1．2．1细胞培养HTh74细胞株贴壁生长在含GAT-3’，下游5’．TCAAACATGATCTGGGTCAT．10％胎牛血清的Ham’sF12培养基中，置于373’；ABCG2(234bp)上游5’．TGTAGCAACACT—收稿日期：201

7、4—11—30基金项目：国家自然科学基金资助81102032通讯作者：郑旭琴，E-mail：zxq5126@163．corn·8·实用临床医药杂志第l8卷达ABC转运家族中ABCG2和MDR1基因。ABCverapamil[J]．Cancerresearch，1981，41：1967．[10]DtinmezY，AkhmetovaL，I~eri0D，eta1．EfectofMDR转运体阻滞剂维拉帕米通过提高Caspase．3的活modulatorsverapamilandpromethazineongeneexpression性促进凋亡，增强HTh7

8、4R对阿霉素的敏感性，提levelsofMDR1andMRP1indoxorubicin—resistantMCF_7示维