牛乳铁蛋白卵黄抗体的制备及纯化方法的建立.pdf

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1、第32卷第6期Vo1．32NO．62011年11月NOV．2O11牛乳铁蛋白卵黄抗体的制备及纯化方法的建立江青东，王慧杰(郑州牧业工程高等专科学校继续教育学院，河南郑州450011)[摘要]通过自制并初步纯化牛乳铁蛋白的卵黄抗体，用肌肉和皮下注射结合的方法罗曼蛋鸡进行免疫来制备多克隆抗体。选用150日龄的罗曼蛋鸡4只进行不同浓度的多次皮下免疫注射，采集卵黄抗体并用硫酸铵沉淀法进行抗体的初步纯化，经四次免疫后的罗曼蛋鸡卵黄抗体的效价分别达到了l：32000和l：24000，并在较高水平的情况下维持两周以上，同时经初

2、步纯化后抗体纯度得到了很大提高。试验结果显示肌肉和皮下注射结合的方法对罗曼蛋鸡进行免疫来制备多克隆抗体是可行的，同时通过硫酸铵沉淀法纯化抗体可以达到试验的需求。[关键词]牛乳铁蛋白；卵黄抗体；制备；纯化[中图分类号]$811．6[文献标识码]A[文章编号]1005—5228(2011)06—0071—031960年Groves从牛乳中分离获得乳铁蛋白笼，试验El粮按照NRC(1994)蛋鸡高峰日粮标准配(Iactoferrin，LF)，其分子量为70～80kD，LF广泛制。试验鸡自由采食，自由饮水，室内温度为15

3、～存在于乳汁、唾液、泪液等外分泌液或血浆、中性粒25℃，光照时间为14～16h，定期观察记录，确保动细胞中E1,2]。LF具有多种生物学功能，如参与铁的物健康，产蛋率高。转运和吸收、抑菌效应、调整补体活性、调节免疫系1．1．2试验动物的分组采用随机分组的方法分统、抑制炎症、刺激淋巴细胞生长、抗病毒、防止脂肪为两组，然后分别用0．5mg／mL和1mg／mL对两过氧化、调整胃肠道微生物类群等多种功能[3]。因组蛋鸡进行免疫。此乳铁蛋白在国内外日益成为人们研究的热点。卵1．2仪器和试剂黄抗体亦称卵黄免疫球蛋白(1gY)

4、，是母鸡在体内1．2．1试剂考马斯亮兰R一250、G一250、弗氏完全卵发育过程中，由血清中的lgG转移至卵黄中形成佐剂、琼脂粉均购自Sigma公司，牛乳铁蛋白由河的l7]。与哺乳动物的lgG相比，lgY具有价廉易得、南农业大学生理实验室制备。稳定好、产量高且lgY对酸、酶、温度具有较高的稳1．2．2仪器wH一3型微型旋涡混合仪、磁力搅拌定性等优点。器、水浴锅、恒温培养箱、高压锅、尤尼柯UV一2800因此，建立一套完整的多克隆抗体制备方法显紫外可见分光光度计、DYY一6B型稳压稳流电泳仪得十分必要，本实验是在结合

5、前人实验的基础上摸均购自北京六一仪器厂；Sigma低温高速离心机；冻索和建立了牛乳铁蛋白卵黄抗体的制备及纯化方干机RLPHR1—2(CHRIST)；真空泵(CHRIST)、透法，并通过实验验证其结果是可行的，这将为今后从析膜均购自北京邦定泰克生物技术有限公司。事牛乳铁蛋白卵黄抗体的制备及纯化等领域的研究1．3试验方法提供理论基础。1．3．1牛乳铁蛋白抗原溶液浓度的测定测定方法用考马斯亮兰法¨8]。1材料和方法1．3．2乳铁蛋白油乳苗的制备将浓度为1mg／1．1试验动物mL的牛乳铁蛋白抗原溶液与弗氏完全佐剂等量混1

6、．1．1试验动物条件150日龄罗曼蛋鸡4只，体匀，置于微型旋涡混合仪上使之剧烈振荡使抗原充重2．0kg，购于河南农业大学畜牧站。试验鸡单分乳化，振荡后，1000r／min离心1min。[收稿151期]201110-29，修回日期：2011—11-14[作者简介]江青东(1978一)，男，河南商城人，在读博士，讲师，主要从事哺乳动物泌乳生理学研究。E—mail：Jiangqd2000@126．corn72家畜生态学报第32卷1．3．3罗曼蛋鸡的免疫采用胸肌及颈部皮下多kDa12点注射法，用乳铁蛋白油乳苗在胸肌注射4

7、个点，颈部皮下1个点，每点0．2mL。每隔两周加强免疫一次，共加强免疫三次。1．3．4卵黄抗体(IgY)的提取每次免疫1周后取鸡蛋数枚，采用简单高效的水溶法进行分离和纯化，得蛋黄约13mL／枚。蛋黄液1O倍稀释后用盐酸调节pH到5．0，4℃放置6h，4℃5000r／min离心1h，取上清液加入等体积的饱和硫酸钠溶液，图2纯化IgY的SDS-PAGE分析使饱和度达到5O。4℃放置6h，离心后取其沉1．标准蛋白；2．纯化的卵黄抗体淀，溶于同等蛋黄体积的0．01mol／mLpH7．4Fig．2SDS-PAGEanaly

8、sisofpurifiedIgYPBS中，再加人1／2体积的饱和硫酸钠溶液，使饱和1．Standardprotein；2．Purifiedyolkantibody度达到33，重复上一步操作；用透析膜透析，过滤价有明显升高并能在2周内保持在较高水平。结果灭菌，4℃保存备用。表明，可以通过多次采集全血得到所需抗体，同时乳1．3．5卵黄抗体纯度的检测将初步纯化得到的铁蛋白浓度不