基于表面等离子体共振技术用鸡蛋黄抗体IgY测定人血清中转铁蛋白.pdf

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1、V01．33高等学校化学学报No．62012年6月CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES1177—1181基于表面等离子体共振技术用鸡蛋黄抗体IgY测定人血清中转铁蛋白王春宇，冯锋，白云峰。，陈泽忠。，田茂忠，邱建丁，倪永年(1．南昌大学化学系，南昌330031；2．山西大同大学有机化学研究所，大同037009)摘要采用表面等离子体共振(SPR)方法，用鸡蛋黄抗体(IgY)取代传统免疫检测中哺乳动物抗体IgG作为识别分子偶联于CM5传感芯片上，对人血清中的转铁蛋白进行了检测．考察了IgY在传感芯片上的偶联条件及芯片的再生条件．结果表明，在pH

2、--4．0，IgY浓度为100mL，流速为5ixlVmin的最佳偶联条件下，SPR响应信号和转铁蛋白浓度在50～500ng／mL范围内具有良好的线性关系，检出限为39．56ng／mL，对人血清样品检测的日间变异系数<8％，日内变异系数<5％，平均回收率为86．22％～94．51％．关键词表面等离子体共振；鸡蛋黄抗体；人血清；转铁蛋白中图分类号0657文献标识码ADOI：10．3969／j．issn．0251-0790．2012．06．011转铁蛋白是血清中结合并转运铁的球蛋白J，血清转铁蛋白的含量变化可反映多种疾病，患有缺铁性贫血、急性肝炎及急性炎症的病人血清中转铁蛋白的含量

3、会增多；而患有肾病综合征、肝硬化及恶性肿瘤等疾病时，人血清中转铁蛋白的含量会减少．传统的人血清中转铁蛋白含量的检测方法主要有免疫比浊法J、酶联免疫吸附法j、放射免疫法及压电免疫分析法等．与这些方法相比，表面等离子体共振(Surfaceplasmonresonance，SPR)技术作为一项新的生物技术，具有无需对样品进行处理、免标记、样品用量少和可快速实时检测生物分子相互作用的全过程等优点．7_．传统检测方法中用的抗体多为哺乳动物抗体IgG，而IgG能激活血清中的补体系统J，进而影响抗原抗体的有效化合价；且IgG还会与血清中的类风湿因子和人抗鼠抗体等产生非特异性结合，在免疫检测

4、中产生假阴性或假阳性结果．鸡蛋黄抗体(IgY)是从免疫母鸡所产鸡蛋的蛋黄中提取和纯化出来的抗体．与哺乳动物的IgG相比，IgY不与哺乳动物免疫球蛋白发生交叉反应，不与类风湿因子、人抗鼠抗体或Fc受体结合，不会激活~iti-gL动物的补体系统，可以避免免疫检测中产生假阴性或假阳性现象；且IgY具有耐热、耐酸、稳定及成本低等特点～13]．Vikinge等通过实验证明，在基于SPR技术所进行的检测中，采用I作抗体可以降低非特异性吸附，避免假阴性和假阳性结果，改善SPR在人血清抗原检测中的应用．本文以鸡蛋黄抗体IgX代替哺乳动物抗体IgG用于SPR对人血清中转铁蛋白的实时检测，实验证

5、明该方法简单可行，提供了用SPR检测血清抗原的新试剂和新方法，为高特异性、人性化的蛋黄抗体IgY在生化检测中的进一步应用提供了理论依据．1实验部分1．1仪器与试剂BIAcoreX型表面等离子体共振仪(PharmaciaBiosensorAB公司)．CM5型传感芯片，HBS．EP缓冲溶液(pH=7．4，0．01mol／LHEPES+0．15mol／LNaCI+3mmol／LEDTA+0．05％SurfactantP20)，pH=4．0，4．5，5．0和5．5的醋酸钠缓冲溶液，盐酸乙醇胺溶液和pH=1．5，1．7，2．0，2．5和3．0的10收稿日期：2011-07-21．基金项

6、目：国家自然科学基金(批准号：21175085)和山西省自然科学基金(批准号：2009011015—1)资助．联系人简介：冯锋，男，博士，教授，主要从事化学生物传感技术及功能荧光试剂的制备研究．E—mail：feng—feng64@263．net高等学校化学学报mmol／L甘氨酸一盐酸再生液均为PharmaciaBiosensorAB公司产品；N一羟基琥珀酰亚胺(NHS)和Ⅳ一乙基一Ⅳ一(二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)购于Sigma公司；人转铁蛋白标准品购自美国Fitzgerald公司；鸡抗人转铁蛋白蛋黄抗体购自美国ICL实验室；人血清样品由大同大学附属医院提供；其它

7、试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水；所有溶液均用0．22m(水系)微孔滤膜过滤，并在使用前进行超声脱气处理．1．2实验过程1．2．1鸡抗人转铁蛋白蛋黄抗体偶联条件的选择在室温(25℃)下，分别用pH=3．75，4．0，4．5，5．0和5．5的10mmo]／L的醋酸钠缓冲溶液将鸡抗人转铁蛋白蛋黄抗体稀释到25p~g／mL，以10I~L／min的流速进行预结合实验，根据SPR响应信号选择偶联抗体所需的最佳pH；然后在最佳pH值下对抗体浓度以及流速进行选择．1．2．2鸡抗人转铁蛋白蛋黄抗体的偶联过程先用E