聚肌胞苷酸对人胎盘胎儿源性间充质干细胞细胞因子产生的影响.pdf

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1、细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmuno1)2014，30(1213l5文章编号：1007—8738(2014)12—1315—03聚肌胞苷酸对人胎盘胎儿源性间充质干细胞细胞因子产生的影响刘淑丹，陈冬梅，朱永朝，魏军(宁夏医科大学总医院干细胞研究所，生育力保持教育部重点实验室，宁夏银川750004)[关键词]间充质干细胞；T0ll样受体；免疫调节；聚肌胞苷酸[中图分类号]Q7，PJ92．12[文献标志码]A胎盘来源的间充质干细胞(plancentaderived1．2方法mesenc

2、hymMstemcells，PMSC)越来越多的用于临床1．2．1hfPMSC的培养原代hfPMSC由宁夏医科大学总医治疗J。PMSC免疫调节功能可能与抑制树突状细院干细胞研究所提供J，待原代细胞80％～90％汇合时，以胞、T细胞、B细胞等多种免疫细胞功能，同时释放1：2～1：3的比例传代，以此法进行体外扩增。多种免疫调控因子相关J。其中一些免疫调控因子1．2．2PolyI：C处理hfPMSC在hf'MSC培养基中加入PolyI：C至终浓度为1ng／mL，培养72h后，收集上清液用于ELISA的分泌受

3、到Toll样受体(Tol1．1ikereceptor，TLR)信号检测，消化收集贴壁细胞于一80％冻存用于实时定量PCR通路的调控。因此TLR激活剂可能诱导人胎盘胎儿检测。源性间充质干细胞(humanfetaloriginalplacenta1．2．3流式细胞术检测PolyI：C诱导前后hfPMSC上TLR3的mesenchymalstemceHs，hfPMSC)产生多种抗炎因子表达用1．25g／L胰蛋白酶消化，分别收获PolyI：C诱导前从而增强ht~MSC免疫调节功能。聚肌胞苷酸后的hfPMSC，

4、制成单细胞悬液，并调整细胞数为1×10／mL，(p0ly—inosinicacid：cytidylicacid，PolyI：C)是双链0．1mL分装于流式细胞管，加入51]LR3一PEmAb；室温避RNA(double-s~andedRNA，dsRNA)，可被rI'LR家族光放置20min，用PBS洗2次，流式细胞仪检测。的重要成员TLR3识别，是一种干扰素诱导剂J。1．2．4实时定量PCR检测诱导前后hfPMSC中IL-6、IL-8、本研究测定hiPMSC受到TLR3的激活剂PolyI：C诱IL-1

5、0和TNF一0【mRNA的水平TRIzol法抽提P=5代htPMSC导后，白细胞介素6(interleukin-6，IL-．6)、IL-8、及PolyI：C诱导后hfPMSC的总RNA，反转录为cDNA，实时定IL-10和肿瘤坏死因子0【(tumornecrosisfactoralpha，量PCR测定IL-6、IL-8、IL-10和TNF·Ot的mRNA相对GAPDHTNF一仅)的表达变化，探讨PolyI：C对hfPMSC免疫功的表达量。引物序列见参考文献[5]。采用2△c‘算法计算能的影响，为提高h

6、fPMSC的损伤修复和免疫调节能和统计样品间的表达差异。力，并为其临床应用提供依据。1．2．5ELISA检测诱导前后htPMSC中IL-6、IL一8、IL一10和TNF．的水平将htPMSC按1×10个细胞接种于培养皿1材料和方法中，PolyI：C诱导培养72h后收集上清液。ELISA检测细胞培1．1材料人胎盘经患者知情同意取自宁夏医科大学总医养液上清中IL-6、IL-8、IL．10和TNF—的水平。操作严格按院剖腹产产妇。所用试剂及仪器信息如下：L-DMEM、胎牛血试剂盒说明书进行。清、胰蛋白酶为G

7、ibco公司产品；PloyI：C为Sigma公司产品；1．2．6统计学分析应用SPSS16．0统计软件进行分析，数TRIzol为Invitrogen公司产品；DNA酶1、A型胶原酶为Roche据以4-s表示，组间比较采用t检验并进行方差分析，公司产品；cDNA合成试剂盒、ReMfimePCRMix、PCRMix为P<0．05为差异有统计学意义。Thermo公司产品；PE标记的小鼠抗人单克隆抗体(mAb)(IgG1-PE、CD73一PE、CD105-PE、TLR3一PE)为BD公司产品，2结果人IL-6

8、、IL．8、IL—l0和TNF-ELISA试剂盒为武汉博士德公2．1胎盘间充质干细胞的特征分离自胎盘胎儿侧司产品，倒置相差显微镜及照相系统为Olympus公司产品，来源细胞接种24h有少量细胞贴壁生长(图1A)，CO2培养箱和一80％超低温冰箱为Thermo公司产品；PCR仪和ReMtimePCR仪为Bio—Rad公司产品；引物由生工生物工1周后迅速地克隆性扩增，为成纤维样细胞，呈长梭程(上海)有限公司合成。形，核质比大，胞质透明，呈旋涡状生长。当传至收