高致病性禽流感病毒广谱嵌合抗体的构建表达及活性研究.pdf

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1、第49卷第6期厦门大学学报(自然科学版)Vo1．49NO．62010年l1月JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)NOV．2OlO高致病性禽流感病毒广谱嵌合抗体的构建表达及活性研究夏琳陈毅，罗歆文，新陈¨鸿，霖吴，金君，支0彦宁，傅雅士肖，鑫，夏宁邵(1．厦门大学国家传染病诊断试剂及疫苗工程技术研究中心，生命科学学院，2．厦门大学医学院，福建厦门361005)摘要：高致病性禽流感病毒高度变异且缺乏有效的治疗药物．在前期研究工作中，本课题组发现一株鼠源广谱中和单抗13D4，在动物实验中显示出对H5N1禽流感病毒具有广谱治疗效果

2、．在本研究中，从分泌13D4单克隆抗体的杂交瘤细胞株中抽提总RNA，经RT-PCR扩增出轻重链可变区DNA序列，并分别与人IgG1的轻重链恒定区基因序列拼接，构建人一鼠嵌合抗体．筛选出稳定表达嵌合抗体的CHO细胞株，从培养上清中纯化出嵌合抗体．竞争Elisa结果表明，嵌合抗体与鼠源单抗能够识别同一个抗原表位并具有相似的亲和力．血凝抑制反应和中和活性测定结果证明，13D4嵌合抗体保留了对不同亚型H5N1病毒的广谱反应性，并且对两株H5N1病毒具有中和活性．本研究获得的13D4嵌合抗体将具有潜在的治疗价值．关键词：H5N1；嵌合抗体；广谱活性中图分类号：Q511文献标识码

3、：A文章编号：0438—0479(2010)06—0845～05大部分禽流感病毒只会引起人体的微弱感染L1]，研究者们的目标[8]，并试图将该类单抗人源化后用于1997年首次在香港出现的高致病性禽流感H5N1病人类的感染治疗，避免鼠源单抗的免疫原性带来的副毒则例外，它具有显著的广谱宿主范围，在小型大型猫作用．科、啮齿类、灵长类动物等许多野生动物及家禽中引起我们已报道了一组广谱交叉反应的H5特异性抗致命性疾病[2]．H5N1病毒的持续感染使人类感染致体，其中13D4为最有效的鼠源保护性抗体．动物实验死率超过了6OL3]．M2离子通道抑制剂与神经氨酸证实，13D4鼠单抗对

4、4个tt5N1禽流感病毒代表亚型酶抑制剂为病毒有效的预防制剂，但并不能作为有效1，2．1，2．2，2．3的感染均具有良好的治疗效果[]．本的治疗药物L4]．研究中，我们将构建表达13D4嵌合抗体，旨在大幅度由于抗体介导的主动免疫反应能够阻挡病毒与靶减弱鼠源单抗的免疫原性、延长抗体在体内的半衰期，细胞结合而成为感染的治疗方法之一．1918年“西班为治疗性抗体的研究和抵御高致病性禽流感H5N1牙流感”中输入康复病人的血清减少了50％的致死对人类的危害奠定基础．率[5]，近来严重的H5NI病人从康复者的血清中也成功获得了免疫能力]．已有报道证明鼠源及人源单克1材料与方法隆抗

5、体对H5N1病毒感染前后的动物具有保护效果[7]．针对病毒的高度变异性，筛选特异识别H5N11．1材料病毒抗原保守表位的广谱交叉中和性单克隆抗体成为本研究中所用的大肠杆菌DH5a为实验室保存；真核表达载体peDNA5／FRT／TO、定点真核表达系统Flp—InTM及表达细胞株Flp-InCHO购自Invitrogen收稿日期：2010-04—29公司；转染脂质体Lipofect2000、筛选试剂潮霉素购自基金项目：国家自然科学青年基金资助项目(30901077)；教育部科Invitrogen公司；各种限制性内切酶、LA—TaqDNA聚学技术研究重点项目(108157)

6、；国家传染病重大专项(2008ZX10004-006)；福建省科技计划重点项目合酶、T4连接酶、pMD18-T载体均购自大连TaKaRa(2008Y0059，2009YZOO02)公司；无血清SFM4培养基购自Hyclone公司；灭活*通讯作者：wxluo@xmu．edu．cnH5N1病毒株由香港大学新发传染病国家重点实验室厦门大学学报(自然科学版)提供；13D4鼠单抗，HRP标记的13D4鼠单抗，抗比稀释后与HRP标记的13D4mAb同时加入孔中竞HBVpreS1的4D11嵌合抗体，proteinA和重组HA1争结合病毒．抗HBVpreS1的4D11嵌合抗体用作阴由

7、本实验室研制及纯化．性对照，13D4鼠源单抗作为阳性对照．显色终止后酶1-2方法标仪读值．、1．2．7血凝抑制反应1．2．113D4鼠单抗可变区基因的克隆血凝抑制方法检测嵌合抗体的广谱反应性．根据从13D4杂交瘤细胞株中抽提总mRNA，oligo修改后世界卫生组织动物流感诊断与监督手册中的操dT引物反转录成cDNA(Promega，MadisonWI)．根作方法，血凝抑制可得到与H5N1不同亚型的反应活据Novagen公司Ig—Prime试剂盒的引物序列合成31性[1地]．所用H5N1病毒均为灭活病毒，测定病毒条上游引物和4条下游引物，以eDNA为P