复氧导致的乳鼠心肌细胞凋亡的影响.pdf

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1、中西医结合心脑血管病杂志2015年4月第13卷第4期二甲双胍对缺氧／复氧导致的乳鼠心肌细胞凋亡的影响白鹏’，朱国斌，鲁谦’，边云飞。，周荣摘要：目的通过建立乳鼠心肌细胞缺氧／复氧损伤模型，观察二甲双胍对乳鼠心肌细胞凋亡的影响。方法选用原代培养72h的乳鼠心肌细胞，随机分为4组：空白对照组、二甲双胍组、缺氧／复氧组、二甲双胍+缺氧／复氧组。流式细胞术检测各组细胞的凋亡率，荧光定量PCR检测各组细胞caspase一3mRNA表达，酶联免疫法检测各组细胞胞浆内细胞色素C(CytC)的含量。结果与空白对照组相比，缺氧／复氧组细胞凋亡、caspase一3mRNA表达、胞浆CytC的含量均明显增高

2、(P<0．05)。与缺氧／复氧组相比，二甲双胍+缺氧／复氧组细胞凋亡率、caspase一3mRNA表达、CytC含量均明显降低(P<0．05)。结论二甲双胍可以抑制caspase一3表达，进而减轻缺氧／复氧所致的心肌细胞凋亡，其机制可能与抑制mPTP的开放，减少线粒体内CytC的释放有关。关键词：二甲双胍；心肌细胞；缺氧／复氧；凋亡；caspase一3；细胞色素C中图分类号：R3~92文献标识码：Adoi：1&396~j，issn，1672—1349．2015．04．024文章编号：1672—1349(2015)04一O487—04心肌缺血再灌注损伤(MIRI)机制比较复杂，目前1．2

3、主要试剂Metformin(Sigma)DMEM培养基(武的研究涉及多个环节，包括再灌注诱发的活性氧汉博士德)胎牛血清(四季青)Ⅱ型胶原酶(Sigma)、(ROS)大暴发、细胞内钙超载、炎症反应、能量代谢障0．25％胰蛋白酶(Solarbio)，兔抗鼠0：一肌动蛋白工抗碍、细胞凋亡等机制有关[1]。其中细胞凋亡可能是及FITC羊抗兔Ⅱ抗(武汉博士德)；RNA抽提试剂盒、MIRI发病机制中的重要环节，所以抑制心肌细胞凋亡逆转录试剂盒(TaKaRa公司)；AnnexinV—FITC流式是减轻缺血再灌注损伤的一个重要方面。二甲双胍检测试剂盒(上海凯基生物公司)，Cytc测试试剂盒(metfo

4、rmin)是临床上广泛应用于治疗2型糖尿病的(上海西塘公司)。药物。一项英国前瞻性糖尿病研究(UKPDS34)显示1．3方法单独给予二甲双胍治疗组与传统治疗(饮食控制)组相1．3．1乳鼠心肌细胞培养选取SD乳鼠，75酒精比，糖尿病患者大血管疾病的发生率下降了30％，急浸泡约1min，沿着左腋窝下剪开胸骨，取出心脏，置于性心肌梗死的发生率下降了39％；与磺脲类、胰岛素预冷的PBS中，洗去血污，剥离心房、血管后分离出心治疗组相比，在同等程度的血糖控制下，二甲双胍组在室，眼科剪剪成1mm×1mm×1mm小块，加入59／6降低终点死亡率、全因死亡率更加有效。这些研究的胰酶5mL～6mL缓慢吹打

5、消化约4min，静置待沉显示二甲双胍除了降糖作用外，还具有额外的心血管淀后去掉上清液。向沉淀中加入0．1的胶原酶Ⅱ缓保护作用。进一步研究认为二甲双胍具有改善能量代慢吹打消化3min，自然沉淀后将上清液加入含血清的谢、抗炎、改善内皮功能等作用L3～。近年发现，二甲双培养基中中止消化。重复上述步骤2次～3次，直至胍对心肌缺血再灌注损伤也具有保护作用_5]。但这种组织消化完全。将收集的细胞以1000r／min离心10保护作用是否与减轻心肌细胞凋亡有关，目前相关研min，弃上清，加入2O的培养液重悬细胞，差速贴壁究较少。本实验通过体外培养建立心肌细胞缺氧／复法去除成纤维细胞。收集上清液，细胞悬

6、液中加入氧(H／R)模型，模拟心肌缺血再灌注，观察二甲双胍作5一Brdu至终浓度为0．1mmol／L以抑制非心室肌细胞用于心肌细胞后对缺氧／复氧导致的心肌细胞凋亡的生长，以约1×10／cm。的密度接种于6孔培养板，继影响，并初步探讨其相关机制。续培养48h后更换培养基，倒置显微镜下观察。1材料与方法1．3-2原代心肌细胞的鉴定针对胞浆中a一肌动蛋1．1实验动物新生Sprague—Dawley(SD)大鼠，1白，采用兔抗鼠0t一肌动蛋白I抗和FITC一羊抗兔荧光d～3d龄，雌雄不限，由山西医科大学实验动物中心Ⅱ抗，通过荧光法鉴定心肌细胞。提供。1．3．3心肌细胞H／R损伤模型的建立采用E

7、sumi等的实验方法，配制缺氧液和复氧液。缺氧液组成：NaCI137mmol／L，KCl12mmOl／L，MgCl20．49mmOI，L，作者单位：1．山西医科大学(太原030001)；2．山西医科大学第二医院CaCl20．9mmol／L，HEPES4mmol／L，脱氧葡萄糖10通讯作者：朱国斌，E—mail；baipeng2011@126．commmoI／L，乳酸钠20mmoI／L，pH6．2；复氧液组成：NaCJ·488·CHINESEJO