免疫细胞化学染色技术在胸腹水诊断中的应用(吉林医学定稿)

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1、免疫细胞化学染色技术在胸腹水诊断中的应用宋东明朱安峰（长春市中心医院病理科，吉林长春，130051）【摘要】目的通过借助于抗原抗体的特异性结合，达到识别组织和细胞中某些化学成分的目的，并明确其在细胞内的定位。方法统计2011年全年间门诊、病房已出现胸腹水症状的患者经过脱落细胞学免疫化学染色技术方法处理标本。结果采用半定量法以确定免疫反应的强度，阳性细胞数目及确定抗原存在的部位。结论免疫细胞化学已经成为细胞学诊断最常使用的特殊诊断手段。【关键词】免疫细胞化学；细胞学；抗原修复技术细胞学诊断主要依赖于细胞涂片常规染色检查，取决于其形态学的基本特点。但经常会遇到一些诊断困难病例

2、，对于细胞工作者一个极大的挑战是间皮细胞、组织细胞与癌细胞，特别是腺癌细胞的鉴别诊断，也就是胸腹水中良性间皮细胞与转移癌的诊断问题。此时辅助诊断方法或特殊诊断技术则十分重要。近代研究证实，免疫细胞化学（Immunocytochemistry）已经成为最常使用的特殊诊断手段。该方法是借助于抗原抗体的特异性结合，达到识别组织和细胞中某些化学成分的目的，并能明确其在细胞内的定位。通常将抗体做酶标记以显示颜色，即酶标技术。目前已有多种商品化的单克隆及多克隆抗体，可用于肿瘤来源的鉴别诊断，常常能给诊断以很大帮助。1材料与方法1.1细胞涂片制备本文所检查的对象系我院2011年1年间门

3、诊、病房的出现胸腹水症状的患者，由临床医师在直视或B超、X线、CT引导下进行穿刺抽取浆膜腔积液，每人送检1-2次，经高速（1500—2000r/min）离心10分钟后，撇去上清液，收集沉渣，涂抹法每次制备3张涂片，待涂片潮干时，95%酒精固定15—30分钟，最长不超过3天，经苏木素、伊红（HE）染色，中性树胶封片后，进行光学显微镜下观察。阅片后登记在册，阳性标本归档保存，以备复查比较。1.2免疫化学染色技术方法1.2.1涂片：各种细胞涂片、印片、微量细胞离心涂片及细胞组织微小组织片等均要求均匀，平薄，并保证足够的细胞数。为防止细胞脱落，玻片一定要洗净，最好涂抹多聚赖氨酸。

4、1.2.2固定：适当的固定才能保持细胞的形态特点及抗原性。最常使用的固定液是酒精，酒精能完好地保存胞浆内抗原，包括中间微丝、肽类物质、激素等，但是许多表面抗原则容易丧失。在空气中已经干燥的涂片或微量离心涂片，为检查表面标记物，可以用甲醛丙酮(1：1)或福尔马林丙酮(1：1)缓冲液(PH值7.4)固定。一般要求保证固定10-15min即可。1.2.3免疫细胞化学染色程序：目前本实验室采用PV-9000通用型检测试剂盒，染色过程如下。(1)PBS洗3次，每次3-5min。如需采用抗原修复，可在此步后进行。（目前主要应用微波技术进行抗原修复，频率为2.45GHz，功率30—60

5、0W任意调整，注意温度控制在40—60℃。）(2)3%H2O2室温孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS洗3次，每次2min。(3)滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，4℃冰箱内过夜。PBS洗3次，每次2min。(4)滴加试剂1（polymerhelper），37℃孵育20min，PBS洗3次，每次2min。(5)滴加试剂2（polyperoxidase-anti-mouse/rabbitIgG），37℃孵育20-30min，PBS洗3次，每次2min。(6)滴加DAB显色液，视显色强度决定显色时间(通常需5-30min)。显色液需现用现配，并严格控制配

6、比浓度。(7)自来水充分冲洗，苏木素复染细胞核1-3min。盐酸酒精分化，氢氧化氨返蓝，酒精逐级脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。并备有可靠的阳性及阴性对照。1.3结果判断1.3.1目前本实验室习惯采用半定量法[1]（染色强度指数计算法）代替，其公式简介如下：SⅡ＝（A×0）＋（B×1）＋（C×2）＋（D×3）SⅡ为染色强度指数；A、B、C、D分别代表-、+、++、+++各种染色强度细胞数的%；SⅡ的范围是0—3。“3”代表100%的肿瘤细胞的染色均为D（强阳性），而“0”则代表100%的肿瘤细胞染色均为A（阴性）。1.3.2标记结果的正确判断任何一种免疫细胞化学染色结果，

7、都必须以常规染色光镜形态为基础。必须掌握病变区的细胞形态特点，即选定好免疫细胞化学标记的靶细胞；镜下必须能识别出仍有阳性的内源性酶细胞，防止误认为阳性细胞；多数抗原在组织细胞中的分布是不规则性的，阳性细胞的数量不等，着色深浅不一，呈不均一性；阳性细胞的标准，PAB显色为棕黄色颗粒，背景清亮无着色，使用不同的抗体，阳性颗粒，可分布于不同部位，如淋巴细胞亚型分布于细胞膜，PCNA、P53、ER、PR等分布在细胞核，CK、EMA、CEA、S-100等则分布于细胞浆，细胞核结构清晰，边界清楚；全片染成黄色或深黄色，即使病变着色较深，仍