琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA.docx

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1、琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA琼脂糖凝胶电泳　琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。琼脂糖凝胶电泳操作流程　　准备干净的配胶板和电泳槽　　注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、

2、模糊甚至缺失的现象。　　选择电泳方法　　一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。　　正确选择凝胶浓度　　对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。　

3、　适合的电泳缓冲液　　常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。　　电泳的合适电压和温度　　电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15℃。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象　　DNA

4、样品的纯度和状态　　是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mMNaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。　　DNA的上样　　正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。TIANGEN公司DN

5、A分子量标准每次上样6ul即可得到清晰均匀的条带。　　Marker的选择　　DNA电泳一定要使用DNAMarker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。TIANGEN公司的DNAMarker条带清晰，亮度均匀，质量稳定，是您实验的首选。需要注意的是Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。如果选择λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65℃加热5min，冰上冷却后使用。

6、从而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。　　凝胶的染色和观察　　实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBRGreen，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。TIANGEN公司的GeneGreen相比则是性价比高的低毒替代染料，其灵敏度比传统EB染料高10倍以上。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。实例实验：一、实验原理用于DNA

7、分离，纯化和鉴定的凝胶电泳有二类，一类是琼脂糖凝胶电泳，适用于1kb和大于1kb以上DNA；另一类是聚丙烯酰胺凝胶电泳，适用小于1kb的DNA。琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便，快速分离、纯化和鉴定DNA的方法，已广泛应用于核酸研究中。DNA在琼脂糖凝胶中迁移率和凝胶浓度、DNA分子大小、DNA分子的构象及电泳电压密切相关。染色采用溴化乙锭（EB），EB在紫外钱照射下的发射荧光。EB能插入DNA分子中形成荧光结合物，使发射的荧光增强几十倍。荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估计出待测样品

8、的浓度。二、试剂：1．电泳缓冲液：40mmol/LTris-HCl(pH8.0)20mmol/LNaAC2mmol/LEDTA配制方法：先配50倍电泳缓冲液，用时取5ml，重蒸水稀释至250ml。50倍电泳缓冲配制方法：Tris121.1g无水NaAC41.0gEDTA·Na218.6G先用400ml重蒸水加热搅拌溶解后，再用冰乙酸调节pH至8