鄂柑一号�崭躺俸搜勘涞�AFLP分析.doc

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1、鄂柑一号�崭躺俸搜勘涞�AFLP分析　　摘要：利用ＡＦＬＰ技术，对鄂柑一号�崭蹋ǎ茫椋簦颍酰�ｒｅｔｉｃｕｌａｔａＢｌａｎｃ．ｃｖ．ｐｏｎｋａｎ）的３个少核芽变及其母株进行分子鉴定。筛选了６４对引物，有６０对引物可扩增出清晰的条带，共获得２２８１条清晰的扩增谱带，其中有９对引物可扩增出明显多态性条带，多态性位点共１５个，占总数的０．６６％。结果表明，鄂柑一号�崭痰纳俸搜勘溆梢糯�物质改变引起，通过ＡＦＬＰ技术可以有效鉴定。　　关键词：�崭蹋ǎ茫椋簦颍酰�ｒｅｔｉｃｕｌａｔａＢｌａｎｃ．ｃｖ．ｐｏｎｋａｎ）；芽变；ＡＦＬＰ　　中图分

2、类号：Ｓ６６６．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11417－3556-03　　　　IdentificationofThreeFew-seedMutantfromE-GanNo.1byAFLP　　　　ＸＵＭｉａｏ，ＪＩＡＮＧＹｉｎｇ－ｃｈｕｎ，ＳＵＮＺｈｏｎｇ－ｈａｉ，ＷＵＬｉ－ｍｉｎｇ，ＴＯＮＧＺｈｕ，ＷＡＮＧＺｈｉ－ｊｉｎｇ，ＨＥＬｉ－ｇａｎｇ　　　　　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｒｅｅｆｅｗ－ｓｅｅｄｂｕｄｍｕｔａｔｉｏｎｓａｎｄｔｈｅｉｒｍｏｔｈｅｒｐｌａｎｔ‘Ｅ－ＧａｎＮｏ．１’ｐｏｎｋａｎｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔ

3、ｅｄｂｙＡＦＬＰｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．６４ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｐｒｉｍｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄａｎｄ２２８１ｃｌｅａｒｂａｎｄｓｗｅｒｅａｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍ６０－ｐａｉｒ－ｐｒｉｍｅｒ，fｒｏｍｗｈｉｃｈ９－ｐａｉｒ－ｐｒｉｍｅｒｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｒｅｓｅａｃｈ.Aｎｄ１５ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｂａｎｄｓｗｅｒｅｄｅｃｔｅｃｔｅｄｏｕｔｏｆ２２８１ｔｏｔａｌｃｌｅａｒｂａｎｄｓ；ｔｈｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｒａｔｅｗａｓ０．６６％．Ｔｈｉｓｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔ

4、ｈｅｒｅｗｅｒｅｓｏｍｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｅｖｅｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＥ-ｇａｎＮｏ．１ａｎｄｔｈｅｔｈｒｅｅｆｅｗ－ｓｅｅｄｂｕｄｍｕｔａｔｉｏｎｓ；aｎｄｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｃｏｕｌｄｂｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｅｄｂｙＡＦＬＰ．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｂｕｄｓｐｏｒｔ；ＣｉｔｒｕｓｒｅｔｉｃｕｌａｔａＢｌａｎｃ．ｃｖ．ｐｏｎｋａｎ；ＡＦＬＰ　　　　鄂柑一号是湖北省农业科学院果树茶叶研究所从�崭淌瞪�苗中选出的新品种［１］，是�崭讨械囊桓鲇帕嫉南适称分郑�具风味浓厚、抗寒性强及耐贮藏等优点

5、，但果实种子偏多。进行鄂柑一号的少核育种研究可以提高其经济效益。近年来我们发现了鄂柑一号的３个少核芽变，其所结果实的种子明显少于母株果实，经过几年高接试验，其少核性状比较稳定。但是否为遗传物质芽变引起，仍然不能肯定。　　近年来发展起来的ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ、ＩＳＳＲ、ＭＳＡＰ等分子标记技术可以在芽变早期快速鉴定遗传物质是否发生改变［２－５］。在这些分子标记技术中，ＡＦＬＰ不仅具备其他分子标记的优点，而且在操作过程中用样量少、灵敏度高，且带纹丰富，对于鉴定多态性低的芽变较为适合。　　试验以鄂柑一号的３个少核芽变为材料，利用ＡＦＬＰ技术

6、分析芽变材料及其母株，旨在早期从分子水平鉴定鄂柑一号的少核芽变，缩短育种周期，提高鄂柑一号少核芽变的选种效率。　　１材料与方法　　１．１试验材料　　供试材料来自湖北省农业科学院果树茶叶研究所柑橘资源圃。鄂柑一号及其３个少核芽变：金优－Ｉ、金优－ＩＩ、金优－ＩＩＩ，３个少核芽变于２００６年高接在成年温州蜜柑树上，树体健壮，正常田间管理。试验随机采取供试树体外围的幼嫩叶片，每株进行３次重复，液氮速冻后置于－８０℃冰箱保存备用。　　１．２ＤＮＡ提取　　ＤＮＡ提取采用改进的ＣＴＡＢ法［６］。ＤＮＡ的纯化按照ＴａＫａＲａ公司的纯化试剂盒说明

7、进行，琼脂糖凝胶电泳检测ＤＮＡ。　　１．３ＡＦＬＰ分析　　引物及接头序列参照Ｖｏｓ等［７］的ＡＦＬＰ技术体系，由上海生物工程技术服务有限公司合成，具体见表１，其中Ｅ和Ｍ分别表示ＥｃｏＲⅠ引物和ＭｓｅⅠ引物。　　酶切反应体系２０μＬ，采用ＥｃｏＲⅠ引物和ＭｓｅⅠ两种内切酶，ＤＮＡ２５０ｎｇ，ＥｃｏＲⅠ０．３μＬ，ＭｓｅⅠ０．３μＬ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ２．０μＬ，加灭菌去离子水至２０μＬ，置于３７℃水浴３ｈ，６５℃温浴２．５ｈ，同时进行接头复性，酶切后的ＤＮＡ采用Ｔ４ＤＮＡＬｉｇａｓｅ连接，加入２０μＬ连接混合液：４．０μＬ连接缓冲液

8、，加灭菌去离子水至２０μＬ，混匀后２５℃放置２ｈ。　　连接好的产物稀释１０倍后取５μＬ作为预扩增反应的模板，加入ＭｓｅⅠ引物１μＬ，ＥｃｏＲⅠ引物１μＬ，２×ＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ１０μＬ，去离子水３μＬ。按如下程序扩增３０个循环：９４℃、３０ｓ