用RAPD标记研究苎麻属植物的亲缘关系.doc

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1、用RAPD标记研究苎麻属植物的亲缘关系　　摘要：采用改良ＣＴＡＢ法提取了１３份苎麻属材料的基因组ＤＮＡ，利用ＲＡＰＤ进行亲缘关系分析。从１２０条随机引物中筛选出了２３条引物，对１３份材料共扩增出２３５个条带。根据扩增结果进行聚类分析，得到反映各材料间亲缘关系的树状图。ＲＡＰＤ的分析结果与传统分类学的分类结果基本相符。　　关键词：苎麻；亲缘关系；ＲＡＰＤ　　中图分类号：Ｓ５６３．１；Ｑ７８文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11407－1499-03　　　　GeneticRelationshipamongB

2、oehmeriaspp.RevealedbyRAPD　　　　ＱＩＵＣａｉ－ｓｈｅｎｇ，ＣＨＥＮＧＣｈａｏ－ｈｕａ，ＺＨＡＯＬｉ－ｎｉｎｇ，ＬＩＹｕ－ｊｕｎ，ＺＡＮＧＧｏｎｇ－ｇｕ　　　　　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｌｅａｖｅｓｏｆＢｏｅｈｍｅｒｉａｓｐｐ．ｂｙｉｍｐｒｏｖｅｄＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｏｆ１３Ｂｏｅｈｍｅｒｉａｓｐｐ．ｂｙｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ．

3、２３５ｂａｎｄｓｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙ２３ｐｒｉｍｅｒｓｓｅｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍ１２０ａｒｂｉｔｒａｒｙｐｒｉｍｅｒｓ．Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｔａｎｃｅｗｅｒｅｃａｌｃｕｌａｔｅｄ；ａｎｄｄｅｎｄｒｏｇｒａｍｓｈｏｗｉｎｇｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｈｒｏｕｇｈａｎｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄｐａｉｒ－ｇｒｏｕｐｍｅｔｈｏｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅａｍｐｌｉｆｙｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓ．Ｔｈｉｓｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｗａｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｃｌ

4、ａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ.　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂｏｅｈｍｅｒｉａspp.；ｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ；ＲＡＰＤ　　　　我国是苎麻的发源地，拥有最丰富的苎麻种质资源。国内的科技人员在苎麻资源的搜集、整理、评价方面做了大量工作。　　在植物分类学方面，王文采［１］通过形态学分析对我国苎麻属的３２种１１变种进行了比较全面的描述；臧巩固［２］通过核型分析讨论了苎麻属五组间的进化关系。但是形态学分析和核型分析都有一定的局限性，随着分子生物学的飞速发展，利用分子标记技术对植物进行更加准确客观地分类鉴定和

5、亲缘关系分析成为可能。　　本研究以栽培种苎麻“圆叶青”和其他１２份野生苎麻为试验材料，利用ＲＡＰＤ技术分析它们之间的亲缘关系，同时结合传统分类学分类方法验证其分析结果的可靠性，为分子标记技术在苎麻属植物的鉴定分类及种间亲缘关系上的分析应用提供了依据。　　１材料与方法　　１．１材料　　１３份苎麻材料见表１，均取自国家种质长沙苎麻圃。　　１．２方法　　１．２．１基因组ＤＮＡ的提取与检测ＤＮＡ提取采用改良ＣＴＡＢ法［３，４］并加以改进。取１３份苎麻属材料的幼嫩叶片提取基因组ＤＮＡ。稀释一定倍数后，应用紫外－可见

6、分光光度计检测其在２６０ｎｍ和２８０ｎｍ的吸光值，以测定ＤＮＡ浓度、评估其纯度。　　１．２．２ＲＡＰＤ反应体系的优化参照钟军［５］、任春晓［６］的方法并对影响ＰＣＲ反应的各影响因子逐一进行梯度优化，包括模板ＤＮＡ用量、Ｍｇ２＋浓度、Ｔａｑ酶用量、ｄＮＴＰｓ浓度、退火温度、引物浓度、ＰＣＲ条件等，建立起适合本实验的ＲＡＰＤ反应体系。　　１．２．３ＲＡＰＤ扩增、电泳以提取的１３种基因组ＤＮＡ为模板，根据优化后的ＲＡＰＤ反应体系，用１２０条ＲＡＰＤ引物分别进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度２

7、％。ＥＢ染色后使用凝胶成像系统照相，观察记录。　　１．２．４数据统计及遗传多样性分析选择清晰且多态性较高的扩增条带进行统计，相同位置有条带的记为“１”，无条带的记为“０”，失败或缺失的记为“９”。基于扩增产物数据库，应用ＮＴＳＹＳｐｃ－２．１０ｅ软件计算相似系数，以获得１３份材料的遗传相似系数矩阵，进而采用ＵＰＧＭＡ法进行聚类分析，以获得遗传树状图谱并进行分析。　　２结果与分析　　２．１基因组ＤＮＡ提取结果　　野生苎麻的含糖量很高，从其中提取高质量的基因组ＤＮＡ具有一定困难。通过改良的ＣＴＡＢ法从野生苎麻

8、叶片中提取的基因组ＤＮＡ，经紫外分光光度计测定，ＤＮＡＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值为１．８～２．０，０．８％的琼脂糖凝胶电泳显示，所提取的基因组ＤＮＡ显示为一条相对清晰完整的带，大小在１９ｋｂ左右，无明显降解痕迹，也没有可见的ＲＮＡ。说明本实验所提取的苎麻基因组ＤＮＡ纯度较高、质量好，符合ＲＡＰＤ实验要求。　　２．２体系优化结果　　通过对各成分进行梯度实验对比得到了较好的ＲＡＰＤ扩增体系和扩增条件，优化后各成分最佳用量如表２，扩