嗜热真菌木聚糖酶1YNA的表达和定点突变.doc

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1、嗜热真菌木聚糖酶1YNA的表达和定点突变　　摘要：为了进一步提高嗜热真菌本已较耐热的木聚糖酶１ＹＮＡ的热稳定性。利用重叠延伸ＰＣＲ技术从嗜热真菌基因组ＤＮＡ中扩增获得了木聚糖酶１ＹＮＡ的基因ｘｙｌ，将其插入到大肠杆菌表达载体ｐＥＴ－２２ｂ中，构建了重组表达质粒ｐＥＴ－２２ｂ－ｘｙｌ。该质粒转化到表达宿主大肠杆菌ＢＬ２１后获得了能成功表达的工程菌。工程菌表达木聚糖酶１ＹＮＡ的最适温度为６５℃，最适ｐＨ值为６．０。其在７５℃，ｐＨ值为６．５的条件下失活处理３０ｍｉｎ后还残存有３０％的酶活，与嗜热真菌生

2、产的木聚糖酶特性相近。在对该木聚糖酶的Ｎ端氨基酸序列进行定点突变后发现，Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｇ、Ｔ４Ｒ均对该木聚糖酶的热稳定性无显著影响，其中Ｔ４Ｇ突变体的耐热性有变弱的趋势。　　关键词：嗜热真菌；重叠延伸ＰＣＲ；定点突变；木聚糖酶　　中图分类号：Ｑ９３９．５；Ｑ７８文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11407－1488-06　　　　CharacterizationandSite-directedMutagenesisofXylanase1YNAfrom　　ThermomyceslanuginosusD

3、SM10635　　　　ＦＵＺｈｅｎｇ１，ＺＨＡＮＧＨｕａ－ｓｈａｎ２，ＺＥＮＧＸｉａｏ－ｙｉｎｇ１，ＸＩＯＮＧＨａｉ－ｒｏｎｇ１　　　　　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎＰＣＲｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗａｓｕｓｅｄｔｏａｍｐｌｉｆｙｘｙｌａｎａｓｅ１ＹＮＡｇｅｎｅｘｙｌｆｒｏｍＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓＤＳＭ１０６３５．ＴｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｃｏｎｎｅｃｔｅｄｗｉｔｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ－２２ｂｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｒｅｃｏｍｂｉｎ

4、ａｔｉｏｎａｌｖｅｃｔｏｒ　　ｐＥＴ－２２ｂ－ｘｙｌ；ａｎｄｔｈｅｎｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｈｏｓｔＢＬ２１．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｘｙｌａｎａｓｅ１ＹＮＡｗａｓ６５℃，ｐＨ６．０．Ｔｈｅｘｙｌａｎａｓｅｒｅｍａｉｎｅｄ３０％ｏｆａｃｔｉｖｉｔｙａｆｔｅｒ３０ｍｉｎｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｔｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｐＨ６．５，７５℃．ＡｆｅｗＮ－ｔｅｒｍｉｎｕｓａｍｉｎｏａｃｉｄｓｏｆｘｙｌａｎａｓｅ１ＹＮＡｗｅｒｅｃｈａｎｇ

5、ｅｄｂｙｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．ＴｈｅｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｘｙｌａｎａｓｅｍｕｔａｎｔｓＴ４ＡａｎｄＴ４Ｒｗａｓｓｉｍｉｌａｒｔｏｔｈｅｉｒｐａｒｅｎｔ，ｗｈｉｌｅＴ４Ｇｓｈｏｗｅｄｗｅａｋｅｒｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ；ｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎＰＣＲ；ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ；ｘｙｌａｎａｓｅ　　　　木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和少量木糖的一类酶的

6、总称。狭义上的木聚糖酶限指内切β－１，４－木聚糖酶，是木聚糖降解过程中最关键的一个酶［１－３］。木聚糖酶在现代工业中的重要性越来越明显。目前该酶主要应用于制浆造纸、饲料和食品等行业。木聚糖酶用于制浆造纸行业的预处理可提高纸浆的白度和减少化学漂白剂的使用；用于饲料行业能增加饲料的利用率和减少动物胃肠道疾病的发生；用于食品行业主要是对小麦面粉的改良和在酿酒方面的应用等。木聚糖酶是利用非淀粉质原料生产酒精过程中的一个关键酶。随着生物质能源事业发展，木聚糖酶必将得到更广泛的应用。　　自１９８３年Ｂｅｒｎｉ

7、ｅｒ等首次从Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ中分离得到木聚糖酶基因以来，许多来自细菌、放线菌、霉菌、酵母菌和藻类等不同生物的木聚糖酶基因被克隆表达和分析。嗜热真菌Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ产生的木聚糖酶由于其高耐热性越来越受到关注［４］。嗜热真菌Ｔ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓＤＳＭ１０６３５是从捷克的土壤中分离得到的一株耐热型菌株，它产生的木聚糖酶是一种耐高温酶，在较高温度条件下稳定。Ｘｉｏｎｇ等［５］对该嗜热真菌ＤＳＭ１０６３５所分泌的木聚糖酶进行了详细的研究。该木聚糖酶属于糖基水

8、解酶第１１家族，其最适ｐＨ值为６．０，最适温度为７０℃，并且在ｐＨ值为５．５～９．０下都具有很高的酶活性。质谱结果还表明嗜热真菌ＤＳＭ１０６３５产生的木聚糖酶的分子量为２１２９５．１７Ｄａ，与ＤＳＭ５８２６产生的木聚糖酶的分子量极为相近。　　耐高温酶的应用前景广阔。在使用酶制剂的工业大生产中，高温过程常常不可避免或对工艺有帮助，例如高温能加快生化反应速度，提高液体物料的流动性能，防止有害微生物在过程中的生长繁殖等，目前大规模使用的酶制剂主要是通过工程菌发酵获得的。基于ＰＣＲ技术的不