低温处理后不同竹种cDNA分子水平上的变化和聚类分析.doc

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1、低温处理后不同竹种cDNA分子水平上的变化和聚类分析　　摘要：以慈竹和硬头黄竹等１２个竹种为材料，采用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ方法，研究低温胁迫后不同竹种ｃＤＮＡ分子水平上的变化。结果是低温处理后，不同竹种的ｃＤＮＡ经不同引物扩增后，其ＲＡＰＤ－ＰＣＲ谱带的变化出现４种类型，即有的竹种出现原有ＲＡＰＤ－ＰＣＲ谱带的缺失、新谱带的出现以及原有谱带强度的增强和减弱，有的竹种ＲＡＰＤ－ＰＣＲ谱带未发生改变，这表明低温处理后不同竹种在分子水平上确实发生了变化，这种变化与低温胁迫有关，且因竹种而异。　　关键词：竹；低

2、温胁迫；ｃＤＮＡ水平变化；聚类分析　　中图分类号：Ｓ７９５文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11407－1484-04　　　　VariationandClusteringAnalysisaboutcDNAofBambooTreatedbyCold　　　　ＨＵＳｈａｎｇ－ｌｉａｎ１，ＣＡＯＹｉｎｇ１，ＤＵＡＮＮｉｎｇ１，ＬIＹｉ１，ＣＨＥＮＱｉ－ｂｉｎｇ２，ＬＵＸｕｅ－ｑｉｎ１，ＪＩＡＮＧＹａｏ１，２　　　　　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆＲＡＰＤ－ＰＣＲｐａｔｔｅｒｎｓａｎｄｃｌｕｓ

3、ｔｅｒｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃＤＮＡｆｒｏｍｔｗｅｌｖｅｂａｍｂｏｏｓｐｅｃｉｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＮｅｏｓｉｎｏｃａｌａｍｕｓａｆｆｉｎｉｓａｎｄＢａｍｂｕｓａｒｉｇｉｄａｅｃｔ．，ｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆＲＡＰＤ－ＰＣＲｐａｔｔｅｒｎｓｏｆｔｈｅｃＤＮＡｄｉｆｆｅｒｅｄｆｒｏｍｓｐｅｃｉｅｓｔｏｓｐｅｃｉｅｓ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌ，ｔｈｅ

4、ｖａｒｉａｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｏｆｄｅｌｅｔｉｏｎｏｒａｐｐｅａｒａｎｃｅｏｆｎｅｗｏｆＲＡＰＤ－ＰＣＲｂａｎｄｓ，ｓｔｒｅｎｇｔｈｅｎｉｎｇｏｒｗｅａｋｅｎｉｎｇｏｆＲＡＰＤ－ＰＣＲｂａｎｄｓｗｅｒｅｆｏｕｎｄ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｎｏｃｈａｎｇｅｏｆＲＡＰＤ－ＰＣＲｂａｎｄｓｗａｓｆｏｕｎｄｉｎｓｏｍｅｓｐｅｃｉｅｓ．ＴｈｅｐａｔｔｅｒｎｃｈａｎｇｅｓｏｆＲＡＰＤ－ＰＣＲｂａｎｄｓｗｅｒｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂａｍｂｏｏｓｐｅｃ

5、ｉｅｓ．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｂａｍｂｏｏ；ｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓ；ｃｈａｎｇｅｓｏｆｃＤＮＡ；ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ　　　　在低温胁迫下植物体内的可溶性糖［１］、可溶性蛋白质和游离脯氨酸、保护酶活性［２］等常发生变化。以往对竹子抗寒性的研究，主要集中在自然条件下与竹子抗寒性有关的生理生化指标的分析上［３－６］，而分子水平的变化鲜见报道，本文以慈竹、硬头黄竹等１２种竹子为材料，采用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术，研究低温胁迫后不同竹种ｃＤＮＡ水平上的变化，为竹子抗寒机制的研究提

6、供理论依据。　　１材料与方法　　１．１材料　　供试材料采自四川青神竹艺城，分别为慈竹、硬头黄竹、小琴丝竹、青皮竹、粉单竹、钓鱼竹、罗汉竹、凤尾竹、斑竹、实心竹、苦竹、巨竹，共计１２种竹子。　　１．２处理方法　　选取长势一致的枝条，将其剪成３０ｃｍ长的枝段，洗净擦干，石蜡封口，置于低温冰箱中－１５℃处理１２ｈ，每个样品设置３次重复。处理后将叶片于液氮中速冻３０ｍｉｎ后保存于－８０℃冰箱。将未处理的枝条叶片于液氮中速冻３０ｍｉｎ后保存作为对照。　　１．３不同竹种叶片总ＲＮＡ的提取和ｃＤＮＡ的合成　　１．

7、３．１叶片总ＲＮＡ的提取将叶片置于液氮中迅速研磨，将研碎的粉末迅速转入１．５ｍＬＥＰ管中，加入Ｔｒｉｚｏｌ试剂，室温下放置１０ｍｉｎ；４℃１１８００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；取上清，加入２００μＬ氯仿，剧烈混匀，室温下放置１０ｍｉｎ；４℃１１４００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ；取上清并加入５００μＬ异丙醇，混匀后于４℃１１４００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ；去上清，７５％乙醇洗ＲＮＡ沉淀；干燥ＲＮＡ沉淀；加入ＤＥＰＣ处理水溶解ＲＮＡ。　　１．３．２ｃＤＮＡ的合成ｃＤＮＡ合成反应由Ｑｉａｎｇｅｎ公司的Ｏｍｉｎｉ

8、ｓｃｒｉｐｔｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｆｏｒ　　ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｋｉｔ反转录试剂盒提供的试剂进行，扩增反应在Ｂｉｏ－ＲａｄＰＣＲ自动扩增仪ＰＴＣ－２００上面进行，２０μＬ扩增体系如表１所示。ＰＣＲ仪中３７℃恒温６０ｍｉｎ，取出产物，－２０℃条件下保存。　　１．４ＲＡＰＤ引物　　根据Ｗｕ等［７］设计的引物，由北京奥科生物技术有限责任公司合成。　　１．５ＲＡＰＤ扩增　　采用１８个ＲＡＰＤ引物对１２个不同竹种的ｃＤＮＡ进行ＰＣ