α-半乳糖苷酶法合成α-半乳糖基-β-环糊精的研究.doc

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1、α-半乳糖苷酶法合成α-半乳糖基-β-环糊精的研究　　摘要：应用发芽咖啡豆α－半乳糖苷酶法合成α－半乳糖基－β－环糊精，研究其合成工艺。通过Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ设计等方法，得出工艺条件为α－半乳糖苷酶用量７３ｎｋａｔ，时间２８ｈ，ｐＨ６．３，温度４０℃，振荡速度７５ｒ／ｍｉｎ，反应体系包括２ｍＬ醋酸缓冲液，β－环糊精０．４ｍｏｌ／Ｌ，蜜二糖０．８ｍｏｌ／Ｌ。在此条件下，α－半乳糖基－β－环糊精绝对产率为２８．４％，比优化前提高了４１．３％。　　关键词：α－半乳糖苷酶；酶法合成；α－半乳糖基－β－环

2、糊精；　　中图分类号：ＴＳ２７３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８11419－4041-03　　　　ＥｎｚｙｍａｔｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆα－Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｂｙα－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ　　　　ＳＨＥＮＷａｎｇ－ｙａｎｇ１，ＪＩＮＺｈｅｎｇ－ｙｕ２，ＧＡＯＨｏｎｇ３　　　　　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓａｆｆｅｃｔｉｎｇｔｈｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆα－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｂｙα－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅｏｆｇｅｒ

3、ｍｉｎａｔｉｎｇｃｏｆｆｅｅｂｅａｎｓｗｅｒｅｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙｓｔｕｄｉｅｄｂｙＢｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎｄｅｓｉｇｎ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ，ｅｎｚｙｍｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，７３ｎｋａｔ；Rｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ，２８ｈ；ｐＨ，６．３；Rｅａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，４０℃；Oｓｃｉｌｌａｔｏｒｙｓｐｅｅｄ，７５ｒ／ｍｉｎ；β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ，０．４ｍｏｌ／Ｌ；ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ，０．８ｍｏｌ／Ｌ；ａｎｄａｃｅｔａｔ

4、ｅｂｕｆｆｅｒ，２ｍＬ，Ｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆα－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎｗａｓ２８．４％ｕｎｄｅｒｔｈｅｓｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｗｈｉｃｈｗａｓ４１．３％ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓbeforeoptimization．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：α－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ；ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；α－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ　　　　环糊精具有内疏水、外亲水的特殊性质，在制药、化工、食品等领域被广泛地研究及应用。但其溶解性

5、能不佳，制约了进一步的应用研究。改性制备分支环糊精，可以扩大分子亲水区域，提高溶解性［１－４］。α－半乳糖基－β－环糊精是一种分支环糊精，是β－环糊精的衍生物，其具有较高的水溶性，分支上的半乳糖基在动物组织中具有特殊的识别受体，具有广阔的应用前景［５－７］。前期研究工作采用江南大学食品科学与技术国家重点实验室自制的发芽咖啡豆α－半乳糖苷酶酶法合成得到α－半乳糖基－β－环糊精，并成功地鉴定了其结构。本实验以β－环糊精和蜜二糖为原料，优化发芽咖啡豆α－半乳糖苷酶法合成α－半乳糖基－β－环糊精的工艺，有利

6、于提高酶法合成的产量和效率，进而指导生产。　　１材料与方法　　１．１材料　　１．１．１试剂发芽咖啡豆α－半乳糖苷酶为江南大学食品科学与技术国家重点实验室自制［８］；对硝基苯酚－α－半乳糖苷和蜜二糖购于Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ贸易有限公司；其余试剂均为国产分析纯。　　１．１．２仪器与设备Ｗａｔｅｒｓ６００高效液相色谱仪，美国Ｗａｔｅｒｓ公司；Ｄｉｒｅｃｔ－Ｑ３超纯水系统，美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司；Ｄｅｌｔａ３２０ｐＨ计，梅特勒－托利多仪器有限公司；ＸＷ－８０Ａ漩涡混合器，上海医科大学仪器厂；８０－

7、２离心机，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；ＨＷ．ＹＳ电子恒温水浴锅，浙江舟山海源仪器厂。　　１．２方法　　１．２．１酶法合成反应将β－环糊精、蜜二糖和发芽咖啡豆α－半乳糖苷酶溶解于２ｍＬ醋酸缓冲液中，使反应缓冲液中包括β－环糊精０．４ｍｏｌ／Ｌ、蜜二糖０．８ｍｏｌ／Ｌ、α－半乳糖苷酶５０ｎｋａｔ。由于水溶性较差，混合体系中的β－环糊精不能完全溶解，呈现过饱和状态，将盛有反应缓冲液的容器置于恒温振荡器中，进行酶法合成反应，反应条件为３０℃，１００ｒ／ｍｉｎ反应３６ｈ。反应结束后煮沸１０ｍｉｎ，使α－

8、半乳糖苷酶充分灭活。灭活后的混合液５０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清液［８，９］。　　１．2．２α－半乳糖基－β－环糊精的高效液相色谱分析及制备①高效液相色谱分析酶法合成反应后的上清液。泵，Ｗａｔｅｒｓ６００；色谱柱，ＨｙｐｅｒｓｉｌＡｓｐ－１－ＮＨ２柱；流动相，７５％乙腈；检测器，Ｗａｔｅｒｓ２４１０差示折光检测器；柱温，３０℃；流速，１.0ｍＬ／ｍｉｎ；进样量，２０μＬ。②采用制备型高效液相色谱对上清液进行分离纯化，对应特征吸收峰收集各组分，得到所需产品。泵，