达氟沙星抗体的制备.pdf

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1、一284一江苏农业科学2010年第3期陈建新，张利明，魏东，等．达氟沙星抗体的制备[J]．江苏农业科学，2010(3)：284—286达氟沙星抗体的制备陈建新，张利明，魏东，刘海斌，李子平(河北北方学院，河北张家口075000)摘要：为了制备达氟沙星(DFLX)多克隆抗体，使用合成的DFLX—BSA偶联物免疫獭兔，用ELISA方法检测抗血清效价。结果显示，2只动物中1只产生了高效价的抗血清，另1只产生的效价较低。得出结论，用合成的DFLX—BSA偶联物免疫兔子获得了高效价的抗血清。关键词：达氟沙星；免疫；多克隆抗体中图分类号：$851．4文献标志码：A文章编号：1002—1302(2

2、010)03—0284—02达氟沙星(danofloxacin，DFLX)又名单诺沙星、达诺沙星，100g／kg，肝脏50，禁用于产蛋鸡。我国农业部于2002商品名advocin，化学名为1一环丙基一6一氟一7一[(1S，4S)年12月24日发布235号公告《动物性食品中兽药最高残留限一5～甲基一2，5一二氮杂二环[2，2，1]一2一庚烷基]一4一量》，规定了达氟沙星最高残留限量：牛(绵羊、山羊)的肌肉氧代一1，4一二氢一3喹啉羧酸，分子式为CH：。FN，O，化学200kg、脂肪100g／kg、肝肾400kg、奶30，家禽结构见图1，相对分子质量357．37，临床上以甲磺酸达氟沙星肌

3、肉200kg、皮+脂100kg，肝肾400g／kg，其他动物常见。肌肉100kg、脂肪5O、肝肾200g／kg。0本研究用Ⅳ一羟基琥珀酰亚胺活性酯(NHS)法将DFLXF／co0H与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原和包被抗原，用免疫抗原免疫獭兔，以获得高效价的多克隆抗体，为进一步研究对达氟沙星残留量的测定奠定基础。1材料和方法H3C图1达氟沙星化学结构1．1材料达氟沙星是氟喹诺酮类药物中抗菌活性较强的药物之1．1．1主要药品及试剂达氟沙星购自中国兽医药品监察一，是动物专用氟喹诺酮类抗菌药物，抗菌谱广，对大多数革所；牛血清白蛋白(BSA，MW：68000)、卵

4、清白蛋白(OVA，兰氏阳性菌、阴性菌都具有很强的作用，对支原体及某些耐药MW：45000)、乙基碳二亚胺盐酸(EDC·HC1)、邻苯二胺菌株也有很强的抗菌性。达氟沙星杀菌活性强、毒性低、水溶(OPD)均购自Sigma公司；二甲基甲酰胺(DMF)购自Gen-性好、体内分布广泛、与其他抗菌药无交叉耐药性，可多种途view公司；Ⅳ一羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自CxbioBiotechnolo径给药，吸收迅速，生物利用度高，组织中浓度高，在低于抑菌gy公司；1％明胶；羊抗兔IgG一辣根过氧化物酶(IgG—浓度的情况下能改变细菌生长速度及细胞形态，对动物呼吸HRP)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐

5、剂购白鼎国公司。道主要致病菌抗菌活性好，是治疗畜禽呼吸系统疾病的理想ELISA试验所用溶液为实验室自配，其他试剂均为分析纯。药物，临床上是治疗深部组织感染、肺部感染(各种肺炎)和1．1．2主要仪器96孔可拆酶标板购自丹麦NUNC公司、脓皮病的首选抗菌药物，特别是在肺和泌尿生殖道能达到较微量加样器、紫外可见分光光度计756PC型(上海光谱仪器高浓度，可广泛用于治疗动物的呼吸道疾病、泌尿生殖道感染有限公司)、高速离心机(D一78532SPRVALLRC5CPLUS)、和支原体病⋯。但随着该药的广泛使用，导致在动物组织中精密电子天平(LIBRORAEG一120)、磁力搅拌器(CJJ一781

6、C产生残留，从而使致病菌产生耐药性且对人类健康产生了一型)、HI8314型pH计、酶标仪为美国Bio—TEK产品(型号为系列的副作用，其残留问题已引起广泛的关注，对其在动物组ELX800)。织中的残留标准也应运而生。FAO／WHO食品添加剂联合专1．1．3试验动物成年獭兔2只，由河北北方学院獭兔繁育家委员会(]CEFA)及欧盟制定了达氟沙星在牛、猪、禽的最高中心提供并负责饲养。残留限量：牛、家禽的肝、肾400g／kg，肌肉200g／kg，脂肪1．2方法及鸡的皮肤100~g／kg；猪肾脏200g／kg，肌肉、脂肪1．2．1免疫抗原DFLX—BSA和检测抗原DFLX—OVA的制备采用Ⅳ一

7、羟基琥珀酰亚胺活性酯(NHS)法]，并略做改收稿日期：2010—02—04进：将20mgDFLX、10mgNHS、12．5mgEDC充分溶解于基金项目：河北北方学院课题(编号：2009023)。1mLDMF中，于室温下搅拌24h，即可得到DFLX反应液。作者简介：陈建新(1967一)，女，河北张家口人，硕士，副研究员，研究称取BSA50mg，使之充分溶解在3mLPBS(pH值7．4)中，方向为药物残留检测。E—mail：~x670218@126．corn。