HBx突变体特异性抗血清的制备及临床研究-论文.pdf

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1、·1112·现代中西医结合杂志ModernJournalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine2014Apr，23(10)HBx突变体特异性抗血清的制备及临床研究陈立加，陈伟才，邓卫武，朱平安(1．广东省佛山市顺德区中医院，广东佛山528300；2．广东省佛山市三水区人民医院，广东佛山528100)[摘要]目的探讨HBx突变体特异性抗血清的制备及临床效果。方法通过多肽合成的方法制备HBx—d431、HBx—d382缺失型突变体特异性多肽抗原，免疫动物制备相应抗血

2、清。产生的抗体经纯化、酶标后，建立检测HBx—d431、HBx—d382特异性多肽抗原及其抗体的ELISA方法。通过对肝细胞癌患者和非肝细胞癌患者临床标本的检测，研究HBx—d431、HBx—d382缺失型突变体多肽抗原及其抗体的临床意义。结果ELISA法研制的兔抗体HBx—d431、HBx—d382多克隆抗体均能与相应的抗原发生反应，并随着兔抗血清稀释的增加，A值会逐渐下降，肝细胞癌组HBxAg—W、HBxAg—m、HBxAb—W和HBxAb—in明显高于正常健康组，差异有统计学意义。结论建立的ELISA方法将可用于

3、HBV相关肝细胞癌的早期诊断、HBV携带者及慢性乙肝患者的监测。[关键词]肝细胞癌；特异性抗血清；HBx—d431；HBx—d382doi：10．3969／j．issn．1008—8849．2014．10．039[中图分类号]R446．6[文献标识码]B[文章编号]1008—8849(2014)10一l112—03原发性肝细胞癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，死亡例非肝细胞癌患者进行分析，进行免疫检测前调整pH值。率极高。在我国，约有1．2亿慢性乙肝病毒(HBV)携带者，1．2HBx的获得PCR获得的野生型及A176

4、2T／G1764A双占全国人口的10％左右，且80％以上的肝细胞癌患者有HBV突变型HBVX基因分别构建于pGEX一6P一2表达载体中，感染的背景。来源于许多肝细胞癌组织中的乙肝病毒x基转化Transl—Blue宿主菌种诱导表达、包涵体复性及纯化。取因(HBx)缺失型突变体HBx—d431、HBx—d382，能加速新西兰雄兔6只适应喂养1周，将其分为野生组和突变组，各QSG7701肝细胞恶性转化，有明显的致瘤作用⋯。因此研究3只。兔耳缘静脉抽血2mL，离心后收集血清，置一70℃环境HBx—d431、HBx—d382突变

5、体的抗原，建立检测HBx—中备用；取rHBxAg—wrHBxAg—IT1分别与等量弗氏完全佐剂d431、HBx—d382突变体实验诊断方法，对于探讨HBx—充分混匀。d431、HBx—d382突变体在诊断HBV相关性肝细胞癌中的应1．3制备方法制备HBx—d431与HBx—d382特异性多肽用价值、了解HBx—d382突变体的临床意义、进一步阐明抗原：分析HBx—d431与HBx—d382缺失型突变体蛋白的免HBx—d431、HBx—d382与HCC的关系都有着非常重要的意疫原性，筛选并合成HBx蛋白共同多肽抗原和HB

6、x—d431与义。本课题拟通过多肽合成的方法制备HBx—d431、HBx—HBx—d382特异性多肽抗原。制备HBx—d431与HBx—d382d382缺失型突变体特异性多肽抗原，免疫动物制备相应抗血免疫血清：多肽抗原与载体结合成免疫原免疫新西兰兔，制备清。产生的抗体经纯化、酶标后，建立检测HBx—d431、HBx—HBx—d431与HBx—d382特异性抗血清，并采用双向免疫扩d382特异性多肽抗原及其抗体的ELISA方法。通过对肝细胞散法、ELISA和SDS—PAGE鉴定抗体的特异性、效价、纯度和癌患者和非肝细胞癌

7、患者临床标本的检测，研究HBx—d431、亲和力。HBx—d382缺失型突变体多肽抗原及其抗体的临床意义。1．4纯化纯化HBx—d431与HBx—d382特异性抗体：采1临床资料用亲和层析法，纯化HBx—d431与HBx—d382特异性抗血1．1材料与条件PCR扩增仪、核酸蛋白测定仪、低温离心清，并对纯化产物蛋白含量、纯度和等电点进行检定。机、台式高速离心机、电子分析天平、酶标仪、洗板机、电泳系1．5ELISA方法的建立将纯化抗体用辣根过氧化物酶标统、凝胶成像系统、超纯水系统、制冰机、一80℃冰箱，超净工记，制备出HB

8、x—d431与HBx—d382酶标抗体，并建立检测作台、数字式酸度计、加热干浴器、扫描仪、振荡混匀器、水浴HBx—d431与HBx—d382抗原的ELISA方法，进行HBx检测。箱、CO培养箱、恒温培养箱、显微镜、电脑等。新西兰雄兔61．6研究方法采用上述建立的ELISA方法对5O例肝细胞只，动物来源：广东省医学实验动物中心。实验