CTGF-siRNA对TGF-β1诱导的肝星状细胞胶原分泌的影响-论文.pdf

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1、中国食物与营养2014，20(8)：64—67FoodandNutritioninChinaCTGF—siRNA对TGF-~I诱导的肝星状细胞胶原分泌的影响张羽飞，李厚忠，高晓，袁晓环，初彦辉’(牡丹江医学院黑龙江省抗纤维化生物治疗重点实验室，黑龙江牡丹江157011；牡丹江医学院医药研究中心，黑龙江牡丹江157011；牡丹江医学院药学院药理教研室，黑龙江牡丹江157011；牡丹江医学院生物技术实验室，黑龙江牡丹江157011)摘要：目的：研究结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF

2、)的小RNA(CTGF-siRNA)对TGF-[31诱导的大鼠肝星状细胞(HSC—T6)胶原分泌的影响。方法：实验分为5组：正常组(单纯c一细胞组)、对照组(F诱导组)、siRNA组、非特异siRNA组、lipo组(脂质体组)。培养大鼠HSC—T6细胞，以10ng／mL终浓度的TGF-fll对培养的HSC—T6细胞进行诱导，再通过脂质体法将CTGF—s转染入c-细胞，通过RT．PCR、Westernblotting方法研究各实验组细胞中CTGF、Ot．平滑肌肌动蛋白(—smoothmuscleactin，．SMA)、I型胶原蛋

3、白(CollagentypeI，Colla1)、纤维连接蛋白(fibronectin，FⅣ)mRNA及蛋白的表达水平。结果：正常组细胞内CTGF有低水平的表达，在给予TGF-~I诱导后表达水平显著升高(P<0．05)；TGF-~I刺激24h后，靶向转染入特异性siRNA后，CF、Collal、刚及Ol—SMA的表达均显著下调(P<0．05)。结论：本研究提示，通过RNA干扰使CTGF基因沉默后，在体外可明显抑制HSC-T6肝成纤维细胞的表型转化及细胞外基质的合成，进一步提示CTGF是促肝纤维化的关键性细胞因子，而RNA干扰是一

4、种特异高效的很有前途的干预手段，为基因治疗肝纤维化提供实验依据。关键词：肝星状细胞；TGF-fll；结缔组织生长因子；siRNA；肝纤维化肝星状细胞(hepaticstellatecells，HSC)是肝纤维物纤维连接蛋白(fibronectin，FⅣ)和I型胶原(Colla．化中细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)的主要来gentypeI，Colla1)的影响。源，在肝纤维化发生、发展中起关键性作用⋯。HSC激1材料与方法活并转化为肌成纤维细胞是肝纤维化发生、发展的核心环节，因此抑制HSC活化是抗肝纤

5、维化治疗的关键步1．1试剂和细胞株骤。结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfac—大鼠肝星状细胞(hepaticstellatecell，HSC．T6)，购自中科院细胞库，培养在含10％胎牛血清的DMEMtor，CTGF)是转化生长因子B(transforminggrowthfac．培养基中。大鼠CTGFsiRNA(序列GenBankaccessiontor，TGF-~I)的下游效应元件，参与了多种器官纤numberNM022266，序列483—503正义链：5-CCG—维化的过程，不仅能特异性介导T

6、GF-~的促纤维化CAAGAUUGGCGUGUGCTT一3反义链：5．GCACACGC—作用，还可直接促进成纤维细胞合成，分泌ECM。本研CAAUCUUGCGGdTdT一3；非特异siRNA正义链：5．GAAU．究应用致肝纤维化细胞因子——F1刺激体外培养GUUUUAAAUGGAGAUdTdT一3，反义链：5-AUCUCCA—的大鼠肝星状细胞株(HSC．T6)，细胞活化后，通过UUUAAAACAUUCdTdT一3)吉玛生物医药技术有限公司RNA干扰技术，将靶向CTGF的siRNA转染到HSC—T6合成。DMEM、Trizol、

7、Lipofectamine2000转染试剂，均细胞株内，研究CTGF-siRNA对活化后的标志物OL一平滑购自Invitrogen公司。逆转录试剂盒，购自大连宝生物肌动蛋白(一smoothmuscleactin，OL—SMA)及活化后产基金项目：国家自然科学基金项目(项目编号：81070329)；黑龙江省卫生厅科研项目(项目编号：2007-001)；牡丹江医学院科学技术研究项目(项目编号B200821)。作者简介：张羽飞(1981一)，女，硕士，研究方向：抗纤维化机制研究。通讯作者：初彦辉(1964一)，男，博士，硕士生导师，

8、教授，研究方向：内分泌疾病的研究。第8期张羽飞等：CTGF—siRNA对TGF-~I诱导的肝星状细胞胶原分泌的影响65公司。抗CTGF多克隆抗体，购自SantaCruz公司，、物经1．5％的琼脂糖凝胶电泳，拍照并利用密度扫描仪一SMA、肌动蛋白(一actin)抗体，购自Abc